Rui Vidal (FFUL) Filomena Nóbrega (EFN) Ana Monteiro (ISA)

1. A biologia molecular na taxonomia Rui Vidal (FFUL) Filomena Nóbrega (EFN) Ana Monteiro (ISA) Colóquio de Fitotaxonomia Instituto Superior de Agronomia 5 de Junho 2001

2. O início da Biologia Molecular Foi em 1953, com a apresentação do modelo estrutural do DNA por Francis Harry Compton Crick e por James Watson Biologia Molecular  Estuda as bases moleculares da vida Relaciona as estruturas das biomoléculas com as funções específicas que desempenham na célula e no organismo.

3. Importância da estrutura do DNA • Suporte universal da informação genética transmitida de geração • em geração • A estrutura do DNA mostra como acontece essa transmissão

4. A partir do DNA é sintetizado o RNA e a partir deste sintetizam-se proteínas Dogma central da biologia molecular

5. Genoma nuclear (nDNA) 1,1×106 a 110×109 Kbp A estrutura dos genomas vegetais • dsDNA linear • Armazena o material hereditário • da célula (DNA) • Coordena as actividades da • célula • Fonte da maior parte dos genes • que codificam proteínas • A maior parte dos genes são • membros de famílias de genes • Hereditariedade biparental

6. A estrutura dos genomas vegetais Genoma mitocondrial (mtDNA) 200-2500 Kbp • dsDNA circular fechado • Maior diversidade dimensional • Hereditariedade uniparental • Baixos padrões de divergência • (muito conservado) • Recombinações rápidas • Grande variabilidade dimensional

7. A estrutura dos genomas vegetais Genoma cloroplástico (clDNA ou cpDNA) 135-160 Kbp • dsDNA circular fechado • O mais utilizado • Relativamente estável no tamanho e • na ordem dos genes • Elevado número de cópias • Alguns genes são de evolução lenta • e outros de evolução mais rápida • Regiões espaçadoras/intrões podem • variar entre espécies relativamente • próximas ou mesmo entre populações • Hereditariedade uniparental: • normalmente materna nas • angiospérmicas e paterna nas • gimnospérmicas

8. Genética • Existência de variação • Custo • Registo de fósseis • Homologia • Evolução convergente • Morfológicos • Bioquímicos • Genéticos MARCADORES Moléculas que caracterizam determinada célula ou organismo

9. Marcadores Morfológicos • Marcadores controlados por genes associados a caracteres morfológicos, em geral características fenotípicas de identificação visual • Número reduzido de marcadores morfológicos • Baixo nível de polimorfismo • Somente identificados, na sua maioria, ao nível da planta adulta

10. Metabolitos secundários Proteínas Isoenzimas Proteómica Fitoquímica Marcadores Bioquímicos Fenótipos moleculares resultantes da expressão de um ou mais genes • Têm elevado nível de polimorfismo • São específicos do ciclo vegetativo das plantas

11. Base genética • Desempenham a mesma actividade catalítica • Podem ter diferentes propriedades cinéticas e ser separadas por • processos bioquímicos • As enzimas de um mesmo grupo diferem entre si na sequência • de aminoácidos que possuem • A premissa básica é que diferenças na mobilidade de isoenzimas • num campo eléctrico são resultantes de diferenças ao nível de • sequências de DNA que codificam tais enzimas Isoenzimas Múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre numa espécie, como resultado da presença de mais de um gene que codifica a mesma enzima

12. A actividade enzimática é detectada in situ através de reacções de coloração histoquímica, como, por exemplo, a formação de um produto corado e insolúvel, visualizando-se num gel diferentes bandas Detecção de marcadores isoenzimáticos

13. Utilização de Isoenzimas • Avaliar os níveis de variabilidade genética de populações • naturais • Estudar o fluxo génico entre populações e processos de • hibridação natural • Estudo da dispersão de espécies • Análise de filogenias • Identificação de variedades

14. Complexidade dos genomas eucariotas Cell and Molecular Biology (Karp, G.) Marcadores Genéticos Regiões de DNA que caracterizam a célula ou organismo

15. Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Basais Não Basais • stDNA (satélites) • Repetições em série de número • variável (VNTR) • Elementos transponíveis (TEs) • DNA telomérico (nuclear) • Regiões codificantes dos rRNAs (rDNAs) • Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS) • Regiões de expressões genómicas (ETS) • Regiões codificantes de isoenzimas e/ou • aloenzimas Marcadores Genéticos

16. Extra-cromossomais Intra-cromossomais DNAs satélites propriamente ditos Minisatélites (10-60 bp) Microsatélites (1-5 bp) Centrómeros Sequências repetitivas agrupadas ou dispersas ao longo do genoma nuclear DNAs satélites

17. Regiões de DNA que podem saltar para outro local no mesmo cromossoma ou para outro cromossoma Classe I Retroposões (retroPns) Classe II Transposões (Tns) • Retrotransposões (RetroTns) • Intrões do grupo II • Plasmídeos mitocondriais de • leveduras • Autónomos • Não autónomos • MITE (miniature inverted • repeat transposable element) Elementos transponíveis (TEs)

18. Barbara McClintock Transposição/Transposões Transposões (Tns) autónomos e não autónomos LTIR (long terminal inverted repeat) STIR (short terminal inverted repeat) Elementos transponíveis (TEs) • As extremidade do elemento transponível contêm sequências repetidas • No local de inserção do transposão há duplicação da sequência alvo • Transmissão vertical (estáveis ao longo das gerações celulares) • Transmissão horizontal (instáveis) • Transposões são específicos para células ou organismos

19. LTR (long terminal repeat) Não - LTR copia gypsy LINEs SINEs Elementos transponíveis (TEs) Retrotransposões (retroTns) • Síntese de um RNA intermédio • Transcriptase inversa • Promovem duplicação da sequência alvo • Agrupados em famílias • Não se inserem em genes funcionais • Transmissão vertical (estáveis) • Transmissão horizontal (poucos casos) • Retrotransposões são específicos para a família, géneros, espécies, • sub-espécies ou variantes de células ou organismos

20. Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Basais Não Basais • stDNA (satélites) • Repetições em série de número • variável (VNTR) • Elementos transponíveis (TEs) • DNA telomérico (nuclear) • Regiões codificantes dos rRNAs (rDNAs) • Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS) • Regiões de expressões genómicas (ETS) • Regiões codificantes de isoenzimas e/ou • aloenzimas Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS e ETS) Marcadores Genéticos

21. Metodologias Físico-Químicas Enzimáticas Clonagem Sequenciação

22. Metodologias Físico-Químicas Hibridação Electroforese em géis

23. Em solução Suporte sólido PCR • Southern blotting (DNA) • Northern blotting (RNA) • Western blotting (Proteínas) Reacção de polimerase em cadeia Metodologias Físico-Químicas Hibridação

24. PCR Polimorfismos de DNA amplificados ao acaso (RAPD)

25. PCR Polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP)

26. Em solução Suporte sólido PCR • Southern blotting (DNA) • Northern blotting (RNA) • Western blotting (Proteínas) Reacção de polimerase em cadeira Metodologias Físico-Químicas Hibridação

27. Southern blotting Polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)

28. Electroforese em géis AGE PAGE Normal PFGE • Unidimensional (1-D) • Bidimensional (2-D) Ribotipia Metodologias Físico-Químicas

29. Electroforese AGE

30. Electroforese PAGE (1-D)

31. Electroforese PAGE (2-D)

32. Sequenciação Clonagem Amplificação Via celular Enzimática Via química Celular PCR Reacção de polimerase em cadeia Metodologias Enzimáticas

33. Selecção do tipo de marcador mais apropriado

34. Parâmetros de decisão • Nível de informação da diversidade • Nível de variação esperada ou indicada • Acessibilidade de sondas e "primers" • Tempo necessário ao desenvolvimento do ensaio • Investimento operacional e financeiro Selecção do tipo de marcador mais apropriado

35. Regiões de DNA codificante de rRNAs Regiões de DNA codificante de proteínas Regiões de DNA não codificante Selecção do tipo de marcador mais apropriado Classificação biológica Reino Divisão Classe Ordem Família Género Espécie

36. Biologia Molecular no Século XXI Genómica Proteómica

37. Acumulação exponencial de sequências Actualmente o GenBank contém registados mais de 11 biliões de bp de cerca de 100.000 espécies Genómica Análise global, via informática, dos genomas e dos genes a partir das sequências depositadas em bancos de dados, tendo em vista o rastreio e a elucidação dos mais variados marcadores e "sinais" que controlam as expressões génicas como também a estrutura e a organização dos genomas

38. Genómica Estrutural Genómica Funcional Estudo das semelhanças e diferenças contidas nas sequências de genomas diferentes ou das proteínas por estes codificadas Estudo das funções dos genes e das proteínas Genómica comparativa Bioinformática Tecnologias já desenvolvidas "Chips" de DNA FISH "Fluorescence in situ hybridization" Fibras de DNA Genómica

39. A elucidação das organizações dos genomas fomentou o conceito de que só as proteínas, ou seja, os produtos expressos dos genomas, é que são os elementos responsáveis pela viabilidade das células Mais importante Estudar o conjunto total das proteínas (proteoma) que são expressas num determinado período de vida das células e dos organismos Genómica Estrutural

40. Proteómica de Expressão Estuda e detecta as mudanças globais da expressão génica Proteómica Quantitativa Estuda e detecta o equilíbrio das expressões génicas assim como das alterações induzidas por perturbações Proteómica de Mapeação Celular Estuda e detecta sistematicamente as interacções proteína-proteína Proteómica • Se e quando os produtos génicos proteicos são expressos • Qual ou quais o(s) grau(s) de modificação após síntese dos produtos • génicos proteicos • Quais as concentrações relativas dos produtos génicos proteicos

41. Genómica Proteómica Epigenética Sintenia Estudo da ocorrência de 2 ou mais locus conhecidos no mesmo cromossoma, tendo em vista responder a questões de homologia residual entre cromossomas completamente homólogos nas suas origens Estuda as alterações hereditárias na expressão génica sem que ocorra qualquer alteração nas sequências genómicas

42. A importância da biologia molecular na taxonomia de plantas é enorme, com múltiplas facetas e com especial incidência na resolução de algumas situações ambíguas