基因工程 Gene Engineering

1. 高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材 基因工程Gene Engineering 彭银祥等编著 第4章 基因工程操作的主要技术及原理 Main Techniques and principlesin Gene manipulation 华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷

2. 4.1 核酸的提取与纯化 • 基因工程中操作的主要对象是？DNA • DNA通常包括那些？ • 基因组DNA、质粒DNA • 提取基因组DNA做什么用？

3. 获得目的基因， • 构建基因组文库 • Southern杂交 • 限制性核酸片段长度多态性分析（RFLP） • 提取质粒DNA做什么用？ • 用于克隆目的基因的载体 • 重组质粒的酶切鉴定分析 • 重组质粒保存目的基因，

4. 4.1 核酸的提取与纯化 由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。

6. 大肠杆菌基因组DNA

7. 4.1.1 质粒DNA的提取

8. plasmid DNA Genomic DNA The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.

9. 1 .碱抽提法提取质粒DNA （1）原理 变性 强碱 DNA双链 DNA单链 中性 复性 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；

10. 染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。 变性

11. （2） 所用的试剂作用 ① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH>8）下有活性。 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。

12. ③EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 ④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。

13. ⑤ NaAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 ⑥ 乙醇 用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。

14. ⑦ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑧ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。

15. 选用 ⑨ 酚-氯仿 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。

16. （3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步：溶菌 使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。 Solution I的配制： 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A

17. 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 Solution II 的配制： 0.2N NaOH，1.0%SDS 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制： 3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）

18. 第四步：离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。 第五步：纯化DNA 上清液过柱或酚-氯仿抽提。 第六步：沉淀DNA 0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。

19. 2. 影响质粒DNA产量的因素 最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。 （1）受体菌株 一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。 endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。

20. （2）质粒拷贝数 这是直接决定DNA产量的重要因素之一。 质粒本身的性质所决定。 （3）质粒大小 分子量大的质粒，拷贝数少。

21. 若干常用质粒的理论产量

22. 4.1.2 基因组DNA的提取 1.细菌基因组DNA的制备 一般过程及原理： （1）细胞裂解 10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。 不用NaOH !

23. （2）DNA纯化 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。 （3）沉淀DNA 0.6倍体积的异丙醇。

24. 2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 一般过程及原理： （1）组织粉碎 动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。

25. （2）细胞裂解 0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。 SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。 （3）DNA提取 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 （4）沉淀DNA 用2倍体积的无水乙醇。 （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） （5）除去RNA污染 用RNase A。

26. 3. 从植物组织中制备 DNA 一般过程及原理： （1）组织粉碎 用液氮冷冻后研磨成细粉末。 （2）细胞裂解 用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 65 oC温育。

27. （3）DNA提取 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质。 （4）沉淀DNA 用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。 （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。 （5）除去RNA污染 用RNase A。

28. 4. DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法 原理： DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。 蛋白质在280nm处有吸收峰 用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。

30. 2. 凝胶电泳估计 原理： 溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。 与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。

31. 2 DNA分子量的估计 一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。 DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。 Marker Marker

32. 4.2 DNA的凝胶电泳 4.2.1 电泳的基本原理 1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

33. 4. 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。 5. 如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。

34. Increasing degree of supercoiling Relaxed supercoiled 相同分子量的DNA: 闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。

37. 4.2.2 琼脂糖凝胶电泳 1. 琼脂糖 是一种线性多糖聚合物，从海藻产物琼脂中提取而来。 2. 琼脂糖凝胶 琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。 琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。 浓度高 空隙小

38. 3. 琼脂糖凝胶的分辨力 空隙大小决定其分辨分子大小的能力。 空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。

39. 4.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。 琼脂糖凝胶电泳：1000—50000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：1—1000bp

40. 4.2.4 凝胶染色 1. 染料 溴化乙锭。 Ethidium bromide （EB）

41. 2. 原理 EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。

44. UVP全自动凝胶成像分析系统

45. OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统

46. 4.3 核酸的分子杂交 DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。

47. 4.3.1 Southern blot 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。

49. Southern blot 筛选结果

50. 4.3.2 Northern blot 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。