MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute - morgen Dr. Stefan Schürch

1. MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute - morgen Dr. Stefan Schürch Departement für Chemie und Biochemie Universität Bern

2. MASSENSPEKTROMETRIE 57 KLASSISCHES MASSENSPEKTROMETER 100% DETEKTOR MAGNET 120 176 IONENQUELLE 232 288 273 39 29 71 105 91 145 161 216 259 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z

3. MASSENSPEKTROMETRIE: GESTERN - HEUTE - MORGEN O N H H O N O O O O • 100 JAHRE MASSENSPEKTROMETRIE • ANWENDUNGEN IN DER BIOANALYTIK • PROTEOMICS • BRÜCKENMUSTER VON SPINNENTOXINEN • OLIGONUCLEOTID SEQUENZIERUNG N N H H O O O H O P O N O P O N O O O O O O H H H H O O O N H O N H O P O N 2 O O O H N O O H O P O N O O O H H O

4. SIR JOSEPH JOHN THOMSON ENTDECKUNG DES ELEKTRONS (1897) ‘AT FIRST THERE WERE VERY FEW WHO BELIEVED IN THE EXISTENCE OF THESE BODIES SMALLER THAN ATOMS. I WAS EVEN TOLD LONG AFTERWARDS BY A DISTINGUISHED PHYSICIST WHO HAD BEEN PRESENT AT MY 1897 LECTURE AT THE ROYAL INSTITUTION THAT HE THOUGHT I HAD BEEN PULLING THEIR LEGS.’ J.J. Thomson, ‘Recollections and Reflections’, G. Bell and Sons, London 1936.  NOBELPREIS FÜR PHYSIK 1908 SCHEMA VON THOMSON’S KATHODENSTRAHL RÖHRE

5. THOMSON´S PARABEL-SPEKTROGRAPH (1910) Ne20 Ne22 CO Hg

6. DIE 20ER JAHRE - DAS JAHRZEHNT DER ISOTOPEN MASSENSPEKTROGRAPH VON F.W. ASTON (1919), SCIENCE MUSEUM LONDON

7. DIE 20ER JAHRE - DAS JAHRZEHNT DER ISOTOPEN ASTON’S MASSENSPEKTROGRAPH VORLÄUFER SPÄTERER HOCHAUFLÖSENDER MASSENSPEKTROMETER F.W. ASTON IM CAVENDISH LABORATORY, CAMBRIDGE (1920)

8. ISOTOPEN SEPARATION (F.W. ASTON 1920)

9. DIE 30ER JAHRE - IONENOPTIKEN UND THEORIEN ERNEST LAWRENCE ENTWICKELT DAS CYCLOTRON (UC BERKELEY, 1931) HAROLD UREY ENTDECKT DAS DEUTERIUM (1932) JOSEF MATTAUCH UND RICHARD HERZOG ENTWICKELN DAS DOPPELFOKUSSIERENDE (HOCHAUFLÖSENDE) MASSENSPEKTROMETER (WIEN 1934)

10. DER KRIEG - PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE DAS CALUTRON U238 99.2 % U235 0.8% IONEN-AUFFÄNGER ( Ni-FOLIEN ) IONENQUELLE 100 g UCl4 VAKUUM-PUMPEN 7500 m3/s MAGNETSPULEN STROMVERBRAUCH PRO MAGNET 4500 kW (7500 A @ 600 V)

11. PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE - DAS CALUTRON

12. PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE - DAS CALUTRON

13. PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE - DAS CALUTRON MAGNETSPULEN AUS REINEM SILBER VOR DER RÜCKGABE AN DAS US DEPARTMENT OF TREASURY (ca. 1948) A TREASURY OFFICIAL WAS APPROACHED ABOUT THE POSSIBILITY OF LOANING SILVER TO A WARTIME EMERGENCY PROJECT. WHEN THE OFFICIAL ASKED ABOUT THE AMOUNT OF SILVER REQUIRED, HE WAS TOLD THAT THE PROJECT WOULD REQUIRE ABOUT 15’000 TONS OF THE METAL. HIS RESPONSE WAS ‘SIR, WE MEASURE OUR SILVER IN OUNCES, NOT TONS’….

14. DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG CEC Model 21-103 Sector Field Mass Spectrometer (1950)

15. DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG

16. DIE 50ER JAHRE - HOCHAUFLÖSENDE MASSENSPEKTROMETRIE MOLECULES HAVING THE SAME MASS NUMBERS BUT DIFFERING IN WEIGHT BY AN AMOUNT DETERMINED ONLY BY THE DIFFERENCE IN BINDING ENERGIES OF THE NUCLEAR PARTICLES CAN BE CLEARLY RESOLVED... ALFRED O. NIER, SCIENCE 121, 1955, 740.

17. ACCURATE MASS DETERMINATION (PEAK MATCHING) INTENSITY [V] WINDOW [ppm] HIGH REFERENCE UNKNOWN MASS 65 ppm = 0.013 Da LOW REFERENCE

18. ACCURATE MASS DETERMINATION (PEAK MATCHING) THEORETICAL MASS ELEMENTS FOR EVALUATION EXPERIMENTAL MASS ELEMENTAL COMPOSITION DEVIATION FROM THEORETICAL MASS ERROR OF ACCURATE MASS DETERMINATION ON MICROMASS AUTOSPEC: ± 2 ppm

19. DIE 50ER JAHRE - QUADRUPOLEUND IONENSPEICHER WOLFGANG PAUL BESCHREIBT DAS ELEKTRISCHE MASSENFILTER (QUADRUPOL ANALYSATOR) (W. Paul, H. Steinwedel, Z. Naturforsch. 8a, 1953, 448.) PRINZIP DES IONENSPEICHERS 1958 ERSTMALS BESCHRIEBEN (W. Paul) KOMMERZIALISIERUNG DER ION TRAP 1984 (George Stafford, Finnigan Corporation)

20. DIE 60ER JAHRE - QUADRUPOL-MS, GC/MS KOPPLUNG, TANDEM MASSENSPEKTROMETRIE KLASSISCHES MASSENSPEKTROMETER DETEKTOR MAGNET ELEKTRONENSTOSS IONENQUELLE GASPHASEN-VERHALTEN ORGANISCHER VERBINDUNGEN MS 1 Vorläufer CID MS 2 Produkte TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE (McLafferty, Jennings 1967) ERSTES KOMMERZIELLES GC-QUADRUPOL-MS (FINNIGAN 1968)

21. DIE 70ER JAHRE - KLASSISCHE ORGANISCHE MASSENSPEKTROMETRIE 57 STRUKTURAUFKLÄRUNG ORGANISCHER VERBINDUNGEN EI-MS & EI-MS/MS 100% 120 176 232 288 273 39 29 71 105 91 145 161 216 259 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z GC/MS ZUR NATURSTOFF-ANALYSE

22. DIE 70ER JAHRE - EXTRATERRESTRISCHE MASSENSPEKTROMETRIE 1969-1972: SECHS MISSIONEN ZUM MOND MIT GC/MS KEINE BEWEISE FÜR LEBEN MINIATURISIERTE MASSENSPEKTROMETER AN BORD VON SATELLITEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ÄUSSEREN ERDATMOSPHÄRE (SEIT 1961) VIKING MISSION ZUM MARS: VIKING LANDER MIT GC/MS ZUR UNTERSUCHUNG DER MARS-ATMOSPHÄRE (NASA 1975) PIONEER 13 MISSION ZUR VENUS MIT GC/MS (NASA 1979)

23. DIE 80ER JAHRE - GRUNDSTEINE HEUTIGER BIOANALYTIK SANFTE IONISIERUNGSMETHODEN FAST ATOM BOMBARDMENT (BARBER 1981) MALDI (TANAKA 1988, KARAS & HILLENKAMP 1988) ELECTROSPRAY (DOLE 1984, FENN 1988)

24. Lysozym aus Hühnereiweiss 14’300 Da Koichi Tanaka Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 1988, 151-153.

25. M. Karas and F. Hillenkamp, Anal. Chem. 60, 1988, 2299-2301. Serum Albumin aus Rinderblut 66’600 Da M. Karas und F. Hillenkamp

26. MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION (MALDI) 2,5-Dihydroxy-benzoesäure und Cytochrom c Intaktes, protoniertes Biomolekül [M+H]+ Energiereicher Primärstrahl UV-LASER 337 nm, 3 ns + Desorbierte Partikel Ionen, Neutralteilchen, Elektronen + + - 100 Shots @ 3.1 mJ Kollisionskette MATRIX-MOLEKÜLE 350 Shots @ 3.1 mJ

27. MALDI-TIME-OF-FLIGHT MASSENSPEKTROMETRIE LASER = START DSO DETEKTOR = ZIEL PROBE

28. MALDI-TIME-OF-FLIGHT MASSENSPEKTROMETRIE SERUM ALBUMIN AUS RINDERBLUT  SANFTE IONISIERUNG, INTAKTE MOLEKÜLIONEN  EINFACH GELADENE IONEN [M+H]+ / [M-H]-  EINFACHE SPEKTREN: ‘EIN’ PEAK PRO KOMPONENTE  GEMISCHANALYSE IST MÖGLICH POLYETHYLEN GLYKOL 6000

29. ELECTROSPRAY IONISIERUNG Protonen auf Tropfen-Oberfläche + + + + + + + + + + + + + + + + + Verdampfen des Lösungsmittels + Rayleigh-Grenze  Coulomb-Explosion Desorption mehrfach geladener Ionen infolge des selbst erzeugten elektrischen Feldes + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + MASSENANALYSATOR ATMOSPHÄRENDRUCK DETEKTOR SPRAY 5000 V 10-5 mbar 10-2 mbar TROCKNUNGSGAS

30. ELECTROSPRAY IONISIERUNG FLUSSRATEN 2 - 2000 ml/min PROBENVOLUMEN > 2 ml KONZENTRATION > 100 fmol/ml  SANFTE IONISIERUNG  MEHRFACH GELADENE IONEN  IONISIERUNG DIREKT AUS LÖSUNG  LC/MS KOPPLUNG (GEMISCHTRENNUNG, REINIGUNG)

31. ELECTROSPRAY IONISIERUNG Ionen mit erhöhten Ladungszuständen 21+ 20+ 22+ 19+ 23+ [M + nH]n 18+ 24+ 17+ 25+ 16+ 26+ John Fenn 15+ 27+ 28+ 14+ 13+ Horse Heart Myoglobin, 1 pmol/l

32. MASSENSPEKTROMETRIE HEUTE ORGANISCHE MS NIEDERMOLEKULARE ORGANIKA STRUKTURAUFKLÄRUNG, IDENTIFIZIERUNG, QUANTIFIZIERUNG SYNTHESE, NATURSTOFFCHEMIE, UMWELTANALYTIK, FOOD, TOXIKOLOGIE, KRIMINALISTIK, ARCHÄOLOGIE EI-MS, FAB, ESI-MS GC/MS, LC/MS, MS/MS MS IN DER BIOANALYTIK BIOMOLEKÜLE GROSSER MASSER LABILE VERBINDUNGEN MASSENBESTIMMUNG, SEQUENZEN, MODIFIKATIONEN, IDENTIFIZERUNGEN BIO-ORGANISCHE CHEMIE, BIOCHEMIE, BIOLOGIE, MEDIZIN ESI-MS, MALDI-MS LC/MS, MS/MS ANORGANISCHE MS METALLIONEN (ICP-MS) FESTKÖRPER-OBERFLÄCHEN (SIMS) GASANALYTIK (EI-MS & GC/MS)

33. DIE 90ER JAHRE - AUTOMATISIERUNG, HIGH-TROUGHPUT UND PROTEOMICS GENOMICS:  DNA SEQUENZ-ANALYSE  STATISCHE INFORMATION  NUR CODIERTE SEQUENZINFORMATION  VIELE OPEN READING FRAMES PROTEOMICS:  UMFASSENDE PROTEIN ANALYSE  ABBILD DER ZELLE ZU BESTIMMTEM ZEITPUNKT  ERFASSEN DES EXPRESSIONSMUSTERS  DYNAMIK, UP/DOWN REGULIERUNG  ERFASSEN VON MODIFIKATIONEN (PTMs)  MEHR ALS 1 PROTEIN PRO DNA-SEQUENZ  PROTEIN-PROTEIN WECHSELWIRKUNGEN PROTEOM:  TOTALER PROTEINGEHALT EINER ZELLE (M. Wilkins, 1995)

34. PROTEIN IDENTIFIZIERUNG MIT PEPTIDE MASS MAPPING IN-GEL VERDAU TRENNUNG PEPTID-MISCHUNG z.B. TRYPSIN 2D-PAGE ZELLE: 5’000 PROTEINE PROTEIN-SPOTS EXTRAKTION MALDI-TOF-MS MASSEN DER TRYPTISCHEN PEPTIDE SIND CHARAKTERISTISCH FÜR JEDES INDIVIDUELLE PROTEIN PROTEIN-DATENBANK 'PEPTIDE MASS MAP'

35. PROTEIN IDENTIFIZIERUNG MIT MS/MS IN-GEL VERDAU PEPTID-MISCHUNG TRENNUNG z.B. TRYPSIN 2D-PAGE EXTRAKTION ZELLE: 5’000 PROTEINE PROTEIN-SPOTS 1 PEPTID AUSWÄHLEN CID TSYPHG ESI-MS/MS G H P Y T S PROTEIN-DATENBANK PRODUKT-IONEN SPEKTRUM  PARTIELLE AMINOSÄUREN-SEQUENZ

36. TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE MIT DEM TRIPLE-QUAD IONEN-QUELLE 1.QUADRUPOL 3. QUADRUPOL 2. QUADRUPOL DETEKTOR Q3 q2 Q1 GAS VORLÄUFER-IONEN SELEKTION KOLLISIONSZELLE PRODUKT-IONEN ANALYSE NEUTRALTEILCHEN mn CID COLLISION INDUCED DISSOCIATION VORLÄUFER-ION mP PRODUKT-ION mF + + KOLLISIONSAKTIVIERUNG UND FRAGMENTIERUNG DES VORLÄUFER-IONS

37. MODERNE TANDEM-MASSENSPEKTROMETER: QqTOF Gepulste Ionenbeschleuigung Ionenquelle (Electrospray) Detektor Trocknungsgas Q1 TOF QUADRUPOL MASSENFILTER (Vorläuferionen Selektion) q0 Produktionen Analyse QUADRUPOL q0 (Ionen Fokussierung) q2 KOLLISIONSZELLE (rf-only Quadrupol) Reflektor Applied Biosystems / Sciex QSTAR Pulsar Hybrid Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer

38. Applied Biosystems / Sciex QSTAR Pulsar Hybrid Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer

39. ESI-MS EINES TRYPTISCHEN PEPTID-GEMISCHES 547.260 m/z

40. ISOLATION EINES VORLÄUFER-IONS (PEPTID) ISOTOPENPEAKS 547.260 all-C12 547.260 547.595 1 x C13 Dm/z = 0.33  [M+3H]3+ 547.928 2 x C13 1 x S34 DREIFACH GELADENES ION 548.259 3 x C13 m/z MINIMALE KOLLISIONSENERGIE

41. PEPTID-SEQUENZIERUNG MIT TANDEM-MS y2 y1 y3 z2 x2 z1 z3 x1 x3 H - NH - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - CO - OH R4 R3 R2 R1 c2 c3 c1 a2 a3 a1 b2 b3 b1 AMINOSÄURE 1 AMINOSÄURE 3 AMINOSÄURE 4 AMINOSÄURE 2 (FAST) JEDE AMINOSÄURE HAT IHRE CHARAKTERISTISCHE MASSE

42. PEPTID-SEQUENZIERUNG MIT TANDEM-MS 175 803 1187 1088 491 361 262 1001 900 702 589 Val - Ser - Thr - Pro - Thr - Leu/Ile - Val - Glu - Val - Ser - Lys 589.152 y-IONEN-SERIE 490.117 Val Val Pro Ser Thr Glu Leu/Ile Thr Ser Val 129.0 87.0 87.0 99.1 99.1 101.1 97.1 99.1 113.1 101.1 702.209 900.248 175.068 361.116 803.222 1088.283 262.078 1001.239 1187.339 m/z VORLÄUFER-ION m/z 547.26 (3+)

43. CUPIENNIUS SALEI

45. DAS GIFT VON CUPIENNIUS SALEI • 8 - 12 ml TOXIN PRO SPINNE UND MONAT • HOHER SALZGEHALT • FREIE AMINOSÄUREN • PEPTIDE  CUPIENNINE 8 PEPTIDE ~35 AMINOSÄUREN KEINE DISULPHID-BRÜCKEN  CSTX - PEPTIDE CUPIENNIUS SALEI TOXINE 13 PEPTIDE 65 - 78 AMINOSÄUREN STARK VERKNOTETES BRÜCKENMUSTER

46. CSTX-PEPTIDE: AMINOSÄUREN-SEQUENZEN (EDMAN) 10 20 CSTX-1 S C I P K H E E C T N D K H N CC R K G L F CSTX-9 K D D K N C I P K H H EC T N D K K N CC K K G L T CSTX-13 S D C T L R N H D C T D D R H S CCR S K M F   30 40 50 CSTX-1 KL K C QC S T F D D E S G Q P T E R C AC G R P CSTX-9 K M K CKC F T V A D A K G A T S E R C A C D S S CSTX-13 K D V CT C F Y P S Q A K K E L C T C Q Q P 60 70 CSTX-1 M G H Q A I E T G L N I F R G L F K G K K K N K K T K CSTX-9 L L Q K F G F T G L H I I K G L F CSTX-13 K H L K Y I E K G L Q K A K D Y A T

47. 6 Lys His Asn Cys Ile Pro Lys His Asp    Glu Asp 13 Cys Lys CSTX-9 ? Thr Asn   Asp 20 21 Lys Cys Asn Lys  Cys Lys  Lys ? Gly Leu   Thr 32 30 Lys Met Lys Cys Lys Cys Phe Thr Val  Ala TRYPTISCHER ABBAU Asp Ala ? ? Lys   Gly Phe Lys Gln Gly Leu Ala Phe Leu 48 Thr 46 Ser Thr Ser Asp Cys Cys Ser Ala Arg Glu  Gly Leu His  Ile Ile Lys Gly Leu ICK-BRÜCKENMUSTER Phe

48. CSTX-9: CYSTINE-HALTIGE FRAGMENTE AUS TRYPTISCHEM ABBAU 13 His His Glu Cys Thr Asn Asp Lys 6 Asn - Cys - Ile - Pro - Lys ? 30 Cys Lys 21 20 Asn - Cys - Cys - Lys  Cys13 - Cys30 ? 48 46 Cys - Ala - Cys - Asp - Ser - Ser - Leu - Leu - Gln - Lys 27 AMINOSÄUREN 3 DISULPHIDE-BRÜCKEN MASSE 2953.36 Da ? 32 Cys - Phe - Thr - Val - Ala - Asp - Ala - Lys

49. NANO-ELECTROSPRAY IONENQUELLE FÜR GERINGSTEN PROBENVERBRAUCH • PROBENVOLUMEN 0.5 - 5 ml • FLUSSRATE 10-20 nl/min • NADELÖFFNUNG 1 mm • MECHANISMUS WIE ESI • EFFIZIENTE IONISIERUNG • NUR OFF-LINE BETRIEB !

50. Nanospray Ionenquelle