Bacilos Gram negativos não-fermentadores de glicose

1. Bacilos Gram negativos não-fermentadores de glicose Keite Nogueira

2. Importância clínica • As bactérias que compõem o grupo de BGN-NF são consideradas oportunistas. • Têm grande importância clínica em casos de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente em: - unidades de terapia intensiva; - pacientes submetidos a procedimentos invasivos; - unidades de queimados; - em infecções do trato respiratório de pacientes com fibrose cística (FC).

3. Importância clínica • Pseudomonasaeruginosa e Acinetobacterbaumannii estão entre as bactérias mais isoladas em hemoculturas e amostras do trato respiratório de pacientes sob regime de internação hospitalar. • No entanto, os demais BGN-NF representam um percentual pequeno de isolados, quando comparados com outros agentes etiológicos, mas alguns deles apresentam resistência elevada a vários antimicrobianos (Complexo B. cepacia e S. maltophilia) e são capazes de causar infecções graves.

4. Importância clínica • A prevalência de BGN-NF no trato respiratório de pacientes portadores de fibrose cística, tais como Complexo Burkholderiacepacia, StenotrophomonasmaltophiliaeAchromobacterxylosoxidanssubespécie xylosoxidans, tem aumentado nos últimos anos e pode evoluir como colonização persistente e sérios danos pulmonares.

5. Isolamento • A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao laboratório clínico após a coleta. • Em casos onde não é possível o envio ao laboratório em no máximo até 2 horas, manter a amostra refrigerada. • Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em meio de transporte tipo Cary-Blair. • Amostras de sangue devem ser imediatamente inoculadas em frascos apropriados para hemocultura. A • mostra de escarro muito viscoso deve ser previamente tratada com N-acetil-L-cisteína a 0,5%.

6. Isolamento • Meios de cultura necessários para o primo isolamento: - Ágar sangue; - ÁgarMacConkey; • Meios seletivos para amostras provenientes de pacientes com fibrose cística, tais como ágarB. cepacia e meios seletivos para Stenotrophomonasmaltophilia. • Observação: • Os meios de cultura devem ser incubados entre 35ºC e 37ºC, em aerobiose por 24 a 48 horas. • Geralmente apresentam bom crescimento, mas para a cultura de pacientes com FC, às vezes é necessário incubação por até 5 dias

7. Identificação • Triagem inicial • As características das colônias após incubação devem ser observadas macroscopicamente quanto ao tamanho, forma, consistência, cor, produção de pigmento, presença ou ausência de reações hemolíticas em ágar sangue e presença ou ausência de crescimento em ágarMacConkey. Importante também observar o crescimento com 24 a 72 h de incubação, em meios TrypticaseSoy Agar (TSA) e MacConkey, devido ao crescimento lento de alguns BGN-NF.

8. B. cepacea S. maltophilia

9. A. baumanniiShewanellaspp. P. aeruginosa

10. Identificação 1. A partir de umacolôniaisolada, emculturapura com 24 a 72 horas de crescimento, proceder à semeaduraem: • Meioparadiagnósticopresuntivo: Triple Sugar Iron (TSI), EPM - Miliou IAL (Rugaimodificado); • Meiosemadição de corantesparaverificarpigmento e manter o inóculo: Trypticase Soy Agar (TSA) inclinadoouágarcomuminclinado; • Caldoparaverificar o Gram e a motilidadeemlâmina: Trypticase Soy Broth (TSB), oucaldocomum. 2. Incubar a 30ºC por 16 a 48 horas e emseguidarealizar a coloração de Gram, oxidase e a motilidadeemlâmina a fresco. 3. O crescimentopode ser observadoaté 72 horaspelofato de alguns BGN-NF cresceremmais lentamente.

11. Identificação • Semeadura, leitura e interpretação das provas para triagem inicial A - TSI ou IAL- Semear com agulha, picando até o fundo do tubo, e estriar a superfície do meio.- Leitura: • TSI: meio permanece inalterado, vermelho (alcalino), no ápice e na base. • IAL: meio inalterado e crescimento no ápice (pode ser observado pigmento).

13. Identificação B - Oxidase- Umedecer um papel de filtro, colocado no interior de uma placa de Petri, com solução de oxalato de p-aminodimetilanilina a 1% (mais sensível que as tiras);- A partir do crescimento em TSA, esfregar uma alçada da massa bacteriana, no papel de filtro umedecido, com alça descartável ou de platina, pois a alça de níquel-cromo produz uma reação falso-positiva;- A leitura é feita em 15 segundos a 1 minuto.

14. Identificação C - Motilidade- Colocar uma gota do caldo TSB ou outro caldo com crescimento bacteriano (16 a 48 horas a 30ºC) em uma lâmina nova;- A leitura tem que ser rápida porque os BGN-NF são aeróbios, portanto a sobrevivência dos mesmos na lamínula é curta.- Leitura: • Motilidade negativa: movimentos vibratórios fracos ou ausência de movimento; • Motilidade positiva: presença de bactérias cruzando o campo em diferentes direções, sugerindo flagelo polar, ou bactérias girando em torno de si mesmas, sugerindo flagelo peritríqueo.

15. Identificação D - Coloração de Gram- Observar a morfologia das células bacterianas, sua disposição e as suas características tintoriais

17. Identificação • Identificação bioquímica após a triagem inicial- A partir do tubo de TSA inclinado ou ágar comum, preparar uma suspensão bacteriana em solução salina 0,85% estéril, ou água destilada estéril, correspondente à escala 0,5 - 1,0 de McFarland. 1- OF ou MEVAG • Semeadura: Inocular 2 a 3 gotas da suspensão bacteriana em: • Tubo OF ou MEVAG (Meio para o Estudo da Via de Ataque aos Glicídeos) adicionados assepticamente com uma solução aquosa estéril de glicose com concentração final de 1%; • Os tubos são conservados em banho-maria a 56ºC até o momento da inoculação bacteriana; • Em um dos tubos adiciona-se assepticamente uma camada de vaselina líquida estéril, dando condições anaeróbias.

18. Identificação 2- Provas complementares: tubos OF ou MEVAG adicionados assepticamente com uma solução aquosa estéril de adonitol, inositol, lactose, maltose, manitol, sacarose, trealose e xilose (concentração final de 1%); 3- Tubos contendo os aminoácidos lisina descarboxilase e arginina de-hidrolase. Os tubos devem ser incubados em condições anaeróbias, colocando-se uma camada de óleo mineral ou vaselina líquida estéril sobre o caldo; 4- Caldo nitrato e caldo nitrato com tubo de Durhan invertido; 5- Pseudomonaságar P (piocianina) e Pseudomonaságar F (fluoresceína ou pioverdina); 6- Caldos TSB: incubar a 4ºC e 42ºC.

19. Identificação • 7- ágarcitrato de Simmons; • 8- Utilizar os resultados do antibiograma para avaliar os discos de polimixina e imipenem; 9- A partir do crescimento bacteriano em TSA, utilizando a alça de níquel-cromo ou descartável, semear em:- Meio uréia-indol: inóculo denso;- Placa de ágarcetrimide, em estrias;- Inocular em forma de botão as placas contendo ágarDNase, ágar gelatina e ágarlipase;- Ágaresculina, fazendo estrias na superfície;- TSA com 1% de lactose, fazendo estrias na superfície. • Após a semeadura, todos os meios são incubados a 30ºC por 16 a 24 horas, com exceção das placas de ágarMüeller-Hinton com os discos de polimixina e imipenem, que serão incubadas a 35ºC, e dos tubos de TSB para verificar o crescimento em diversas temperaturas.

20. Identificação • MEVAG:Distinguem-se 3 tipos de bactérias: • Fermentativas: a acidificação é rápida e igual nos dois tubos (com e sem vaselina), tornando-os amarelos. Ocorre ou não a produção de gás. • Oxidativas: moderada acidificação na superfície do tubo aberto (amarelo) e pouca ou nenhuma acidificação no tubo fechado (mantém a cor do meio). • Inertes ou Alcalinas: pouca ou nenhuma acidificação no tubo fechado (mantém a cor do meio) e nenhuma acidificação ou uma alcalinização mais ou menos forte na superfície do tubo aberto (OF produz coloração azulada e MEVAG um rosa mais intenso).

21. Identificação • Aminoácidos lisina, arginina:Os tubos testes devem ser comparados com o tubo controle negativo para interpretação dos resultados. A leitura pode ser realizada até 72 h, se não positivar antes. • Reação positiva: intensificação da cor púrpura do meio: indica uma reação positiva devido à liberação de enzimas por descarboxilação / hidrólise com aumento de pH do meio. • Reação negativa: o tubo mantém a cor púrpura original.

22. Identificação • Redução de nitrato: • O teste é revelado através da adição de 3 gotas do reativo de Griss A com 3 gotas do reativo de Griss B no caldo nitrato. • O desenvolvimento de uma coloração vermelha dentro de 1 a 2 minutos indica a presença de nitrito e, portanto, um teste positivo. • Não ocorrendo a coloração vermelha: • O nitrato não foi reduzido, ou • O nitrato foi reduzido a nitrito e este, reduzido a gás nitrogênio livre. • Nestes casos, adiciona-se uma pitada de zinco em pó. Se o nitrato ainda estiver presente, este será reduzido pelo zinco e uma coloração vermelha aparecerá dentro de 5 a 10 minutos, indicando que não houve a redução de nitrato a nitrito, portanto teste negativo. Se ocorrer a redução de nitrato a nitrito e este a nitrogênio livre, a cor não se altera. • Nitrato com Durhan: • Pode-se observar a produção ou não de gás no interior do tubo de Durhan invertido.

23. Identificação • Pseudomonaságar P e Pseudomonaságar F: • Estes meios se destinam a favorecer a síntese da piocianina (ágar P) e da pioverdina ou fluoresceína (ágar F). A piocianina se manifesta corando o meio de cultura de azul-esverdeado, enquanto que a pioverdina o cora em verde fluorescente; • Pseudomonasaeruginosa é a única espécie conhecida de bactéria que produz a piocianina; • Fluoresceína ou pioverdina (F) pode ser produzida por P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida. • Para confirmar a presença da piocianina, pode-se colocar de 1 mL a 2 mL de clorofórmio em contato com o meio de cultura. A piocianina é solúvel em clorofórmio e o meio torna-se azul. A pioverdina é um pigmento não solúvel em clorofórmio.

24. Identificação Caldo TSB para verificar o crescimento a 4ºC e 42ºC: • Reação positiva: ocorre a turvação do meio. • Reação negativa: não se observa a turvação do meio.

25. Ágarcitrato de Simmons: • O teste do citrato de Simmons é indicado para determinar a capacidade de certas bactérias de utilizarem o citrato como única fonte de carbono para o seu metabolismo; • O ágarcitrato de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, fosfato de amônia como única fonte de nitrogênio e o azul de bromotimol como indicador de pH; • Quando a bactéria utiliza o citrato, este é removido do meio e CO2 é liberado. O CO2 combina-se com o sódio, do citrato de sódio e água para formar carbonato de sódio, um produto alcalino. Isto aumenta o pH, mudando a cor do meio de verde (negativo) para azul (positivo).

26. Discos de polimixina e imipenem: • Polimixina: ausência do halo, ComplexoBurkholderiacepacia é intrinsecamenteresistente; • Imipenem: ausência do halo, Stenotrophomonasmaltophilia é intrinsecamenteresistente.

27. Meio uréia-indol: • Esse meio permite a pesquisa simultânea da urease e da produção de indol: • A atividade da urease é detectada pelo crescimento da bactéria em meio contendo uréia e usando um indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a uréia é hidrolisada, a amônia se acumula no meio e o torna alcalino. Ocorre aumento no pH, causando a mudança de cor no indicador de amarelo para rosa pink, indicando uma reação positiva.A ausência de mudança na coloração indica um teste negativo (Figura 17); • O teste do indol determina a capacidade de certas bactérias que possuem a enzima triptofanase de degradar o triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amônia. A presença de indol pode ser detectada pela adição do Reativo de Kovacs, ocorrendo a formação de um anel de coloração vermelho na superfície do meio, indicando uma reação positiva. A ausência de mudança de cor indica que o triptofano não foi hidrolisado e, portanto, a reação é negativa conforme observado na Figura 18.

28. Hidrólise da esculina: • O produto hidrolisado reage com o composto férrico do meio proporcionando um precipitado negro intenso nas provas positivas, podendo ser observado a partir de 6 horas de incubação até 48 horas; • A coloração castanho-escura é considerada prova negativa; • A cor é devida à produção de pigmentos por alguns BGN-NF.

29. Hidrólise da gelatina: • O teste determina a habilidade de um organismo produzir enzimas proteolíticas, a gelatinase que liquefazem a gelatina; • No teste positivo, observa-se um halo leitoso ao redor do inóculo. Se houver dificuldade de visualização do halo, deve-se acrescentar 1 mL a 2 mL de reativo de Frazier ou HCl 1N, banhar a placa e retirar o reativo. Nota-se uma zona transparente ao redor do inóculo produtor de gelatinase

30. Identificação • Hidrólise do Tween 80 – Pesquisa da lipase: • No teste positivo, observa-se uma zona de precipitação ao redor do inóculo.

31. Identificação • ÁgarDNase: • Teste para determinar a capacidade de um organismo produzir a enzima DNase, que é capaz de degradar o DNA; • Este meio pode conter um corante metacromático denominado Azul de Toluidina O (TBO). Quando o DNA é hidrolisado, o TBO é complexado, resultando numa coloração pink ao redor do inóculo, determinando uma reação positiva; • Nos meios que não contêm o corante, deve-se adicionar HCl 1N. A reação positiva apresenta um halo transparente em volta do inóculo, enquanto o restante do meio fica leitoso.

32. ONPG • TSA com 1% de lactose - Prova daß galactosidase – ONPG: • A presença ou ausência da atividade da enzima ß-galactosidase é demonstrada quando se emprega o composto orgânico – ONPG. • Numa reação positiva, o reativo ONPG que é incolor, é hidrolizado liberando um composto cromogênico amarelo, o orto-nitrofenil.

34. Identificação • Coloração de flagelos é uma prova complementar utilizada, se necessário. • Para a visualização da disposição e número de flagelos (polar único, polar >1, peritríqueo).

35. Identificação • Principais semelhanças entre S. maltophilia e Complexo B. cepacia: • Reação de oxidase lentamente positiva; • Móveis; • Lisina positiva; • Hidrólise da esculina variável. • Principais diferenças:- S. maltophilia • Produzem DNase; • Imipenem R; • Oxidam a maltose rapidamente (antes da glicose). • - Complexo B. cepacia • Não produzem DNase; • Polimixina R; • Oxidam a maioria dos açúcares.

41. Resistência • Em geral, os BGN-NF apresentam uma alta resistência aos antimicrobianos. • Os principais problemas em BGN-NF são a resistência aos carbapenêmicos, que pode ser devida a diversos mecanismos de resistência, tais como: • Produção de ß-lactamases (metalo-ß-lactamases); • Perda de porina; • Bomba de efluxo

42. Resistência • P. aeruginosaprodutora de metalo-ß-lactamases tem sido detectada em diversas partes do mundo. • Complexo B. cepacia é intrinsecamente resistente a agentes antimicrobianos, incluindo ß-lactâmicos, exceto carbapenêmicos • S. maltophiliaé intrinsecamente resistente aos ß-lactâmicos, inclusive carbapenêmicos, devido à produção de ß-lactamases e baixa permeabilidade da membrana celular. • Um dos grandes problemas no ambiente hospitalar é a multi-resistência apresentada por algumas cepas de Acinetobacterbaumannii, alguns sensíveis apenas à polimixina. • Chryseobacteriumtambém apresentam resistência à polimixina B.