Mit jelent az, hogy NMR spektroszkópia ?

1. Mit jelent az, hogy NMR spektroszkópia ? • Mit jelent az, hogy NMR ? • Nuclear • Mmagnetic • Rresonance • Mit jelent az, hogy spektroszkópia ? http://.tonga.usp.edu/gmoyna Spektrum = színkép ? Az anyag (minta, vizsgált molekula) és az elektromágneses sugárzás kölcsönhatását vizsgáljuk. Kölcsönhatás leggyakoribb formája : abszorpció Az elektromágneses sugárzás tipusai : g-sugárRöntgenUV VIS IR m-hullám radio 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 100 102 hullámhossz (l, cm)

2. A molekulák (elemi részecskék) nem vehetnek fel tetszőleges energiaállapotot. (Kvantumelmélet) • Magasabb frekvencia – nagyobb energia • Hullámhossz-energia : fordított arányú összefüggés. A hullámhossz/frekvencia függvényében minőségileg más –más tipusú kölcsönhatások jönnek létre, más jellegű belső energiák változnak meg. : • „Kvantumlétra.” • g/Röntgen-sugárzás – belső héj elektronjai, magenergiák • UV/VIS – vegyérték(kötő)elektronok • IR – rezgési energiák(kötéshossz/kötésszög) • NMR – Magspin energiák DE = h n E l

3. Az NMR spektroszkópia jelentősége • Szerkezeti kémia • Szerves kémia: Minőségi analízis. Új vegyületek • szerkezetvizsgálata. Enantiomer tisztaság vizsgálata. • Természetes vegyületek szerkezetvizsgálata.. • Metabolitok vizsgálata • Fizikai-kémiai vizsgálatok • Gazda-vendég kölcsönhatások. • Reakciókinetika • Makromolekulák háromdimenziós szerkezete • Peptidek, fehérjék, enzimek • DNS/RNS, DNS/RNS komplexek • Poliszaharidok • Gyógyszerkutatás • Receptor kötődési vizsgálatok • Orvostudomány: diagnosztika • Magnetic Resonance Imaging (MRI)

4. Az atommagok egy makroszkópikusan nehezen értelmezhető sajátsággal, un. spinnel rendelkeznek • Az NMR spektroszkópia számára csak azok az atommagok érdekesek, • ahol aspinkvantumszám (I) 0 • Az atommagok csoportositása : • Páros tömegszám és rendszám I= 0 (12C, 16O) • Páros tömegszáméspáratlan rendszám • I= egész szám (14N, 2H, 10B) • Páratlan tömegszám I= 1/2, 3/2, 5/2…stb • (1H, 13C, 15N, 31P) • Másik lehetséges csoportositás NMR szempontból: természetes előfordulás szerint • Egy mag lehetséges spinállapotai(m) • mneve:mágneseskvantumszám m = I, (I - 1), (I - 2), … , -I

5. A legfontosabb (és általunk tárgyalt ) magok (1H, 13C, • 15N, 31P) eseténI = 1/2, tehát • Ennek eredményeképpen csak két energiaszintet • kell figyelembe vennünk • Az atommagok további fontos paramétere az un. • mágneses momentum (m), amelyet kifejezhetünk: • Ez egy vektormennyiség, amely megadja a mag által • reprezentált „elemi mágnes” irányát és nagyságát, ahol • ha Planck konstans • ga giromágnesesállandó, amely függ a • mag anyagi minőségétől. • Minden egyes mag mágneses momentuma • (és természetesen giromágneses állandója) különböző. m = 1/2, -1/2 m = gI h / 2p

6. Egy spin energiája egy polarizáló külső mágneses térben (Bo, ) • a tér nagyságától és a mágneses momentumtól (m:) függ. • A külső Botér bekapcsolásakor a spinek energiája felhasad. • Két energiaszint lép fel, a külső térrel paralell és antiparallel • állapot. Az energia a két vektor szorzataként írható le a követ- • kezőképpen • Az energiakülönbség a két nívó, • a and b, között • Az energiakülönbség a polarizálóBo, tértől függ. A nivók. • benépesítettségeDE függvénye, amit egy Boltzmann tipusú • eloszlásból kiszámíthatunk • A DE1H esetén 400 MHz-en (Bo = 9.4 T) 4 x 10-5 Kcal / mol. Bo m Bo m E = - m .Bo Eb = gh Bo/ 4p Ea = - gh Bo/ 4p DE = gh Bo/ 2p Na / Nb = e DE / RT • AzNa / Nb arány • csak1.000064.

7. NMR mérés érzékenysége • Érzékenységet befolyásoló tényezők • 1) Giromágneses tényező : g3 (m, Na / Nb,a tekercs mágneses • fluxusa) • 2) Természetes előfordulás (izotóp %) • pl : • 13C mérés 64-szer érzéketlenebb a giromágneses tényező értéke miat ! • Amennyiben a temészetes előfordulást 13C (~1%)is számbavesszük, 6400 –szer kevésbé érzékeny ! • A rezonancia-frekvencia az energiakülönbség értékéből • számítható: • DE = hno • DE = gh Bo / 2p • 1H magokra a jelenleg ismeretes mágnesek (2.35 – 23.5 T) • esetén a rezonancia 100 MHzés 1GHz közötti értéken • jöhet létre g13C = 6,728 rad / G g1H = 26,753 rad / G no = g Bo/ 2p

8. noértékéből adható meg aprecesszó sebessége, az un. Larmor frekvenciawo, i wo=2pnowo= g Bo (radian) • A precesszió magyarázata :minden mag (mágneses és • nem-mágneses) rendelkezik szögmomentummal ((L) • A magokat mint kis mágneseket • képzeljük el, melyek tengelyük • körül forognak • A spinekre két erő hat a polarizáló mágneses tér • bekapcsolása után: • Bo, kényszeríti a térirányba történő beállást • igyekeznek megtartani a szögmomentumot m L wo m Bo L

9. Eredő mágnesezettség • A mintát alkotó elemi mágneses momentumok a B0 tér • bekapcsolása után rendezettséget mutatnak. Ennek eredménye • az eredő mágnesezettség megjelenése, melyet egy • koordinátarendszerben ábrázolva érthetünk meg • Ha felbontjuk a m vektort a z and <xy>,komponensekre z x A mágneses térrel parallel és antiparallel beállású vektorok aránya Na/Nb. y Bo z z z = Mo x y y Bo = “0” x Az eredő mágnesezettség a Bo irányába mutat, ezt hasznosítjuk az NMR -benl

10. Az NMR jel észlelése • A B0 tér bekapcsolása (illetve a minta mágneses térbe való • helyezése) még nem eredményez NMR jelet, csak a nívók • (egyébként nem észlelhető) felhasadását • A mintának energiát kell abszorbeálni. Az energiát egy • oszcilláló elektromágneses sugárzással tudjuk biztosítani. • ( B1 tér bekapcsolása) z B1= C * cos (wot) Mo x B1 Bo y i adótekercs (y) z z Bo Mo Bo B1kikapcsolva x x B1 Mxy wo y y wo

11. Az Mxymágnesezettség észlelése • AB1 oszcilláló mágneses tér kikapcsolása után az Mxy • vektor vissza fog térni a ztengely irányába ( egyensúlyi Mo,) • és visszaáll az eredeti spineloszlás (Na / Nb) • relaxáció • Mxyvektor visszatéréseztengely irányába: precesszió az • <xy> sikban • Az Mxyvektor oszcillációja egy változó mágneses teret • jelent, amely egy tekercsben áramot indukál: z z Mo egyensúly. x x wo Mxy y y z x Bo wo Mxy y  NMR jel Vevőtekercs (x)

12. Az NMR spektrométer • Az NMR spektrométer alapvetően egy nagy és drága FM rádió. • Mágnes- Ma döntően szupravezető mágnesek. • Frekvenciagenerátor – Előállítja azwo frekvenciát, amely • aB1 teret indukálja. CW és pulzustechnika. • Detektor - érzékeli a mágnesezettséget az <xy>síkban • Recorder - XY plotter, oszcilloszkóp, számítógép, stb Bo É D Mágnes B1 Rekorder Frekvencia generátor Detektor

13. NMR spektrométerek egykor és ma

14. A kémiai eltolódás jelensége • Ha minden magnak egy jellemzőwoLarmor freknciája van egy • adott mágneses térben, mire jó az NMR spektroszkópia? • Minden egyes mag megérzi azt akémiai környezetet, amely • befolyásolja a körülötte kialakuló effektív mágneses teret, mely • a polarizáló és a helyi mágneses tér együttes hatására alakul • ki körülötte • Beff = Bo - Bloc --- Beff = Bo( 1 - s ) • s neve :mágneses árnyékolás. A mágneses árnyékolást • befolyásolja a szomszédos magok, csoportok jelenléte, az • elektronfelhő, azaz a molekulában levő kötések, hibridállapot • stb. • Ennek alapján az etanol spektrumának így kellene kinézni: HO-CH2-CH3 low field high field wo

15. Az etanol spektruma (kisérleti eredmény) J. T. Arnold, S. S. Dharmatti, M. E. Packard, J. Chem. Phys.1951, 19, 507 BME, 1995

16. C H 3 H C S i C H 3 3 C H 3 • A kémiai eltolódás skála (d, ppm) • Lehetne frekvencia skálát is alkalmazni. Nehézkes, mivel • Bloc isokkal kisebb, mintBo, a számláló viszonylag kicsil • (néhány száz Hz), míg a nevező nagy (száz MHz). • Egy relatiív skálát használunk, minden jelet egy belső • standard vegyület bizonyos jeléhez vonatkoztatva,. • A skála előnye, hogy minden műszeren mért eredmény • összehasonlítható. • Általános belső standard atetrametilszilán • (TMS), mivel oldható a legtöbb • oldószerben, semleges, könnyen • eltávolítható és 12 ekvivalens1H • és 4 ekvivalens13C atomot tartalmaz w - wref d = ppm (parts per million) wref

17. Kémiai eltolódás skálák • 1H, ~ 15 ppm: • 13C, ~ 220 ppm: Alkoholok, ketonoka protonjai Aromás H Amidok Sav OH Aldehidek Olefinek Alifás H ppm 15 10 7 5 2 0 TMS Aromás C, konjugált alkének C=O ketonok Alifás CH3, CH2, CH Olefinek ppm 210 150 100 80 50 0 TMS C=O savak, aldehidek, észterek Heteroatomhoz kapcsolódó C

18. 1 H 1 3 C 1 1 H H • Csatolási állandók • Egy mag spinállapotait befolyásolhatja a szomszédos spinek • energiaállapota, mely kölcsönös. Ez a jelenség a csatolás. • A csatolás legtipikusabb esete a molekula elektronfelhőjének • közvetítésével jön létre – a kötésen keresztül. • Energiaszintek: Mindegyik spin nivóján további felhasadás • észlelhető • A felhasadás nagysága a csatolási állandó, (J) melyet Hz.- • ben mérünk. Nem függ a mágneses térerőtől! A csatolási kép • és a csatolási állandó a kémiai szerkezet meghatározásának • alapvető eszköze • . Három kötés Egy kötés J (Hz) bIbS I S aIbS bIaS S I I S aIaS

19. Fourier transzformáció • Ma szinte minden NMR spektrométer ezen az elven működik. • Egy hangszer „sajátfrekvenciájának” meghatározása. • a) rezonanciapartner frekvenciájának lépetése (CW) • b) szélessávú gerjesztés és a jel időfüggésének vizsgálata • RF pulzus : az összes lehetséges frekvenciát tartalmazza • Az NMR detektor jele: intenzitás-idő függvény. Mi intenzitás- • frekvencia függvényt tudunk értékelni, számunkra ez hordozza • a hasznos információt. Az időfüggvényből a kívánt frekvencia- • függvényt a Fouriertranszformáció segítségével nyerjük. • Frekvenciafüggvényből időfüggvényt inverz Fourier transz- • formáció segítségével kaphatunk. • Pulzustechnika + Fouriertranszformáció az NMR mérés- • technika forradalmi megújítása – Ernst, 1965  S(w) = ∫S(t) e-iwtdt S(t) = (1/2p)∫S(w) eiwtdw -  -

20. Szabad indukció lecsengés (FID) • A hasznos NMR jel az<xy>síkban elhelyezett vevőtekercsben • megjelenő, a precesszáló mágnesezettség által indukált áram. • Az eredő mágnesezettség relaxáció által visszatér az • egyensúlyi állapotba. A vevőtekercs egy csillapított • koszinuszfüggvényt detektál. (amennyiben egyetlen rezonan- • ciafrekvencia van - a spektrum egy jelből áll) Mxy w=wo idő Mxy w-wo > 0 idő

21. A valóságban akár több száz különböző spin is alkothatja • mintánkat, így a válaszfüggvény is bonyolult, mi ezeknek a • kombinációját észleljük a detektorban. Ez a szabad indukció • csökkenés vagy Free InductionDecay (FID): • Ennek Fourier transzformáltja a spektrum

22. Adatfeldolgozás, szorzófüggvények • A jel digitalizált formában a számítógépben tárolható.. • A FID információtartalma az adatgyüjtés folyamán csökken. • AhogyMxymágnesezettség csökken, egyre több és több • zajt detektálunk. • A zaj nagyfrekvenciájú, véletlenszerű jelenség. Az FID FT • előtti alkalmas függvényekkel való szorzásával a spektrum • zajos alapvonala „simítható” Jel + zaj… zaj 1

23. Legalkalmasabb egy exponenciális szorzófüggvény, • melynek matematikai alakja: • Eredmény: a frekvenciafüggő adatfüggvény konvoluciója az • időben csökkenő exponenciális függvény Fourier-transzfor- • máltjával. A szorzófüggvény Fourier-transzformáltja egy un. • Lorentz függvény. • Az LB paraméter értékének (előjelének) változtatásával a • jel-zaj viszony, illetve a felbontás változtatható az adott célnak • megfelelően. F(t) = 1 * e - ( LB * t ) - vagy - F(t) = 1 * e - ( t / t ) LB

24. A jel/zaj viszony (vagy felbontás) módosítása Az exponenciális szorzófüggvény kitevőjétől függően jel/zaj viszony vagy felbontás javítás érhető el ( a másik paraméter némi romlása árán) LB = 5.0 Hz LB = -1.0 Hz FT FT

25. Spektrumakkumuláció Zaj : sztohasztikus (véletlenszerű) jelenség jel/zaj viszony javítása: akkumuláció ( a kisérlet megismétlése, az eredmények összeadása, ma már számítógéppel) N akkumuláció N1/2 szeres javulást eredményez

26. Pulzusszekvenciák • Az NMR kisérletek épitőelemei. Egy kisérlet a szekvencia • többszöri (sokszori) ismétléséből épül fel. A legegyszerübb • 1-pulzusos kisérlet • Vektorábrán • Sematikusan jelölve • A pulzusnak „iránya” is van, használhatunk 90x or 90y • pulzusokat. A gyakorlatban az több adó-, illetve vevő- • tekercset helyeznek el 90o-onkét, ezeket felváltva használják • (kereszttekercses elrendezés) z z Mo x 90y x pulzus Mxy y y adatgyűjtés 90y 90y n

27. Inverzió visszaállás • Spin-rács relaxációs idő(T1) • Értéke a molelulán belüli lokális mozgékonyságra jellemző. • Közvetlenül a FID-ből, illetve a spektrumból nem határozható • meg. • A következő pulzusszekvenciával határozható meg : • I A p pulzus után • Megkezdődik az egyensúly visszállása, a (T1) relaxágiós idő • által meghatározott sebességgel. Különböző tDvárakozási idő • utánegy újabb 90o-os pulzussal tudjuk „kiolvasni” a mágnese- • zettség aktuális értékét 180y (or x) 90y tD z z 180y (or x) x x tD y y

28. Inverzió visszaállás tD = 0 z z x 90y x FT y y tD > 0 z z x 90y x FT y y tD >> 0 z z x 90y x FT y y

29. Ennek linearizálásával T1kiszámítható. Inverzió visszaállás 40oC • Az intenzitás-idő (td), • összefüggés I(t) = I * ( 1 - 2 * e - t / T1 ) Intensity ( ) time

32. Felix Bloch Edward Purcell

33. Jean Baptiste Joseph Fourier Richard Ernst Bay Zoltán

34. Néhány fontos NMR- aktív mag

36. metszet koponya térdkalács gerincoszlop

38. Peter Mansfield Paul Lauterbur

39. HO-CH2-CH2D (I) HO-CHD-CH3 (II) DO-CH2-CH3 (III) R = 3 * II / I C = (I + II) / (S * k)

41. Nátrium koncentráció viszonyok változása sejtekben és környezetükben PPP DOTP TTHA