EPIGENÉTICA: IMPRINTING GENÔMICO e miRNA

1. EPIGENÉTICA: IMPRINTING GENÔMICO e miRNA Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

2. O QUE SÃO FENÔMENOS EPIGENÉTICOS? • São alterações herdáveis na expressão gênica sem modificações na seqüência de bases do DNA - Reversíveis

3. ONDE OS PROCESSOS EPIGENÉTICOS OCORREM? • DNAMETILAÇÃO Promotor Silenciamento ACETILAÇÃO METILAÇÃO • HISTONASBIOTINILAÇÃO FOSFORILAÇÃO UBIQUITINAÇÃO SUMOilação “Código de histonas” Compactação da cromatina

4. METILAÇÃO DO DNA • Dinucleotídeos 5’-CpG-3’: união de uma citosina a uma guanina por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA  ilhas CpG  regiões promotoras dos genes • Metilação do DNA: ocorre normalmente em cerca de 70 a 80% dos sítios CpG, sendo que essa porcentagem aumenta com o envelhecimento.

5. METILAÇÃO DO DNA Como ocorre: - Adição covalente de um grupo metil no carbono 5´ da citosina na molécula de DNA  5-metilcitosina - Doador: S-adenosilmetionina (SAM) metabolismo do folato e micronutrientes (vit B12, B6, colina e metionina) - Catalisador: DNA-metiltransferases DNMTs (vários tipos e isoformas)

6. DNMT1:atua no DNA hemimetilado durante a replicação  mantêm o padrão normal de metilação durante as divisões celulares DNMT3: metilação de novo  envolvida no imprinting parental

7. METILAÇÃO DO DNA O resultado da metilação do DNA: silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação

8. METILAÇÃO DO DNA Função: - É essencial para o desenvolvimento normal - Tem ação : 1. no controle da expressão gênica espacial e temporal 2. na integridade cromossômica e segregação centromérica 3. nos eventos de recombinação 4. inativação do cromossomo X 5. proteção contra elementos genéticos móveis 6. imprinting genômico 7. envelhecimento

9. METILAÇÃO DO DNA • A metilação pode ocorrer em 2 regiões ricas em dinucleotídeos CpG distintas: • Ilhas CpG: região promotora • Regiões intergênicas (regiões não codificadoras) • -heterocromatina pericentromérica – condensada e inativa; • -retrotransposons; retrovirus endógenos ou sequências repetitivas → metilação pode estar envolvida como mecanismo de defesa do hospedeiro para prevenir a mobilização desses elementos e reduzir a ocorrência de rearranjos cromossômicos

10. HIPOMETILAÇÃO X HIPERMETILAÇÃO A função normal da célula depende de um equilíbrio entre os dois eventos: Ilhas CpG: hipometiladas Regiões intergênicas: hipermetiladas

11. REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO CA CANCER J CLIN 2010;60:376–392

12. HISTONAS • Determinam grau de condensação da cromatina  • reprime a transcrição • Interação entre elas grupamentos adicionados • Eventos epigenéticos: • -Acetilação (lisina) • -Metilação (lisina ou arginina) • -Fosforilação (serina) • -Ubiquitinação (lisina) • -Ribosilação

13. CÓDIGO DE HISTONAS in vivo 28: 287-292 (2014)

14. CÓDIGO DE HISTONAS METILAÇÃO HISTONAS TRANSCRIÇÃO ATIVA cromatina aberta SILENCIAMENTO GÊNICO HMT (metiltransferases de histonas) Metilação da lisina H3K9me2 e m3 H4K20 H1K26 H3K27me2 e me3 Metilação da lisina H3K4me2 e me3 H3K9me1 H3K36 H3K79 Desmetilases de histonas: remoção de grupos metil

15. ACETILAÇÃO DAS HISTONAS • Controlada pelas histonas acetiltransferases (HATs) e desacetilases de histonas (HDACs) • Acetilação (HATs): histonas H3 e H4 → abre a cromatina, ativa a transcrição. Ativação de vários genes inibitórios do crescimento tumoral • Desacetilação (HDACs): condensa a cromatina, impede a transcrição • DNMTs: recrutam HDACs e outras proteínas de ligação a cromatina no sítio promotor do gene para a desacetilação das histonas

16. Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma Ilhas CpG não metiladas e histonas acetiladas  nucleossomos em configuração aberta  cromatina descondensada  acesso aos fatores de transcrição Genes transcricionalmente ativos

17. Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma Ilhas CpG hipermetiladas e histonas desacetiladas  regiões de heterocromatina  inativação gênica  nucleossomos mais compactados  cromatina condensada  grupos metil fornecem barreira física para acessibilidade aos fatores de transcrição  inibe acesso de proteínas reguladoras que promovem a transcrição

18. METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESE • Levam a uma variedade de cânceres por alterar a expressão de genes críticos. • Dois padrões de metilação distintos: • - hipometilação generalizada do genoma (10%) frequente sequencias do DNA repetidas (DNA satélite, LINE e SINE), retrotransposon e genes cópia única (oncogenes: c-Myc, MAGE, CDH3, c-Ha-Ras) – reativação de genes silenciados. • - hipermetilação que se apresenta em áreas localizadas dentro da região promotora de genes supressores de tumor, fatores de transcrição; controle do ciclo celular, genes anti-apoptóticos, genes de reparo do DNA e ncRNA (miRNA) • Inativação gênica epigenética: tão comum quanto a mutação no desenvolvimento do câncer • Alterações epigenéticas estão envolvidas na iniciação e progressão do câncer

19. METILAÇÃO DO DNA E CÂNCER ANORMAL

20. METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESE • Hipermetilação de ilhas CpG: silenciamento de genes supressores tumorais e genes de reparo • Hipótese de Dois Eventos Mutacionais: • -1o. Mutação herdada ou somática • -2o. Deleção ou perda de heterozigosidade • ou • Inativação epigenética do gene (hipermetilação) • no 1o. ou 2o. Evento

21. Padrões aberrantes de metilação e câncer: • São específicos ao tecido e tumor  biomarcador do câncer • tumores derivados de diferentes tecidos mostram padrão único de alterações de metilação do DNA • Amostras de DNA derivadas do tumor  obtidas de biópsias, plasma, saliva, semen, fluídos gastrintestinal e broncoalveolar, urina e fezes ESTRATÉGIAS PARA DETECÇÃO DE BIOMARCADORES Câncer de próstata:hipermetilação nos genes: GSTP1distingue lesão benigna de maligna RAR estágio mais avançado Câncer de pulmão: hipermetilação dos genes: MGMT, P16, RASSF1A, DAPK, RAR (soro dos pacientes)  marcador de câncer com sensibilidade de 51% Câncer de bexiga: urina Hipermetilação de RB, P16, P14, APC, RASSF1A Perfil de metilação do DNA: Triagem populacional p/detecção precoce de câncer especifico  testes não invasivos Câncer endometrial:secreção vaginal  hipermetilação CDH12, HSPA2, MLH1, RASSF1A, SOCS2

22. IMPRINTING GENÔMICO É um subgrupo distinto de regulação epigenética em que a atividade de um gene é reversivelmente modificada dependendo do sexo do genitor que o transmitiu • Processo em que genes específicos são diferencialmente “marcados” durante a gametogênese parental → expressão diferencial de alelos dependendo da origem materna ou paterna • Assegura a expressão transcricional herdada paternalmente ou maternalmente • Somente um dos 2 alelos parentais herdados é normalmente expresso e o outro alelo é reprimido • Expressão monoalélica devido a padrão de metilação • Imprinting pode ser tecido específico ou tipo celular específico: AS → expressão monoalélica em neurônios mas não na glia.

23. IMPRINTING GENÔMICO • 1984: ovos de camundongos manipulados com 2 pró-núcleos maternos (ginogenoto) ou 2 pró-núcleos paternos (androgenoto) → não desenvolviam normalmente e não sobreviviam • Ginogenoto: formação do embrião, mas pobre desenvolvimento de tecido extra-embrionário • Androgenoto: melhor formação de tecido extra-embrionário, mas pobre desenvolvimento do embrião Diploidia Uniparental: presença de 2 genomas haplóides materno ou paterno

24. IMPRINTING GENÔMICO Imprinting confirmado: Materno: 1,7, 11,14, 15, 18, 20 Paterno: 1, 6, 7,11, 14, 15, 19 e 20 2004: 75 transcritos imprintados de 13 cromossomos diferentes Genes imprintados atuam no crescimento embrionário e desenvolvimento e outros influenciam o comportamento após nascimento.

25. Consequência Funcional: Para que serve • Funcionalmente estes genes serão “haplóides”. P M • O gene A tem somente expressão “materna” (alelo paterno inexpressivo), enquanto o C somente “paterna” (alelo materno inexpressivo). O produto de ambos é o normal e suficiente para o funcionamento da célula. • O gene B tem expressão em ambos os alelos, e seu produto também é normal para o funcionamento da célula.

26. Imprinting genômico • Metilação está habitualmente envolvida quer ativando ou inativando os genes • Genes imprinted estão presentes em clusters • Ex: • H19p/Igf2m(11p15.5) • Um dos genes origina 1 proteína o outro RNA não traduzido (cerca de 25% dos genes imprinted não originam proteínas) • Os genes são separados por ilhas CpG as quais são locais de ligação de CTCF, formando uma fronteira cromossômica acentuadores

27. Imprinting genômico – H19/IGF2 e doenças H19/IGF2: perda de imprinting e expressão aberrante: super crescimento somático e tumores embrionários -câncer: tumor de Wilms, colorretal, pulmão, mama e próstata -Síndromes de Beckwitt Wiedmann (11p15) UPDp(60% casos)expressão bialélica de IGF2: estimula o crescimento celular

28. ERROS NO PROCESSO DE IMPRINTING Erros no processo de apagar e remarcar o imprinting em uma geração: pode gerar cromossomos de diferentes origens ancestrais (avós maternos e paternos) com diferenças na expressão

29. Em cada geração: o imprinting herdado do genitor do sexo oposto deve ser apagado e restabelecido novo imprinting nas células germinativas conforme o sexo do indivíduo

32. UPD(7)mat

33. IMPRINTING GENÔMICO Síndrome de Prader-Willi Gene ?? SNRPN*m del(15q11q13)pat (70%) Dissomia materna:upd(15)mat (25%) Defeito de metilação Hipotonia - Baixa estatura Mãos e pés pequenos Obesidade severa Polifagia RM brando a moderado http://www.aafp.org/afp/20050901/827.html

34. IMPRINTING GENÔMICO Síndrome de Angelman http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0370-41062004000500011&script=sci_arttext Síndrome da criança feliz RM grave Retardo do desenvolvimento Boca grande – língua protusa Convulsões Surtos de riso Gene E6-AP*p (ubiquitina) Expressão monoalélica no cérebro del(15q11q13)mat (68%) Dissomia paterna: upd(15)pat (7%) Mutação no ICR (centro imprinting) - (4%) Mutação no gene UBE3A (5%)

35. Doenças com fenótipos únicos: mas de origem genética em alguns pacientes (deleção) ou origem epigenética em outros (UPD).

36. EPIGENÉTICA X GÊMEOS MONOZIGÓTICOS (MZ)Por que gêmeos MZ não são 100% concordantes? Qualquer alteração de novo ou epimutação afetando o epigenótipo durante a gametogênese ou embrião antes da clivagem dos MZ → irá afetar ambos os gêmeos de forma concordante Epigenótipo sofre mudanças (metilação do DNA e estrutura da cromatina) da fertilização → blastocisto e durante o desenvolvimento Qualquer discondância entre MZ pode ser atribuída a mudanças epigenéticas após a clivagem ao invés de etiologia poligênica

37. Em quase todas doenças Mendelianas com o gene identificado → uma parcela pequena de pacientes em que não são encontradas mutações após sequenciamento total (éxons e regiões não-codificadoras) Possibilidade: Alterações epigenéticas ou genéticas que afetam a expressão gênica.

38. EPIGENÉTICA: SUSCETIBILIDADE À DOENÇAS Marcas epigenéticas aberrantes no útero: pode aumentar suscetibilidade a doenças no adulto Dieta da gestante afeta padrões epigenéticos: transcrição ou silenciamento estabelecidos precocemente e mantidos durante a vida Dieta materna e suscetibilidade a doenças metabólicas: obesidade, intolerância a glicose, diabetes tipo II, e doenças relacionadas: aterosclerose e cardiovascular

39. IMPLICAÇÕES CLÍNICAS • Todo processo epigenético tem potencial de ser revertido  a sequência de DNA do gene metilado permanece inalterada • Marcador molecular para diagnóstico precoce do câncer • Desenvolvimento de novos agentes terapêuticos: • -inibidor de metilação (análogos de nucleosídeos): síndrome mielodisplásica,leucemias e tumores sólidos • -5-azacitidina e 2’-desoxi-5azacitidina (Decitabine)  aprovado para uso clínico - efeito citotóxico e mutagênico • -após conversão é incorporada no DNA no lugar da citosina  DNMTs inativadas  inibição da metilação Podem desreprimir genes supressores de tumor silenciados e restaurar sua função normal

40. IMPLICAÇÕES CLÍNICAS • Desenvolvimento de novos agentes terapêuticos: • -inibidores da DNA-metiltransferase: • -menos tóxicos em modelos pré-clínicos • -sinérgicos aos desacetilantes de histonas • -porém não específicos • -efeitos colaterais:trombo e neutropenia • -inibidores de HDAC (desacetilação de histonas): • -usado em combinação com inibidores de metilação (efeito aditivo ou sinergístico) • -Ex.: Tricostatina, derivados do ácido hidroxâmico, derivados de benzamida • Combinação de drogas novas com as convencionais • Não são específicas  reativação indiscriminada de genes

41. Epigenética: Dieta e Ambiente • Epigenótipo: mais suscetível a influências ambientais que o genótipo • Exemplos: • ICSI e fertilização in vitro: aumenta o risco de defeitos de imprinting epigenético → efeito ambiental (cultura) • Interação entre epigenética e envelhecimento → envolve mudanças epigenéticas cumulativas • Ácido fólico: pode influenciar a expressão de genes imprintados→ biosíntese de purinas e pirimidinas e produção de SAM → doador primário da reação de metilação

42. http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/table.htmlhttp://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/table.html

43. CLASSES DE RNA snRNA(small nuclear): processamento de RNA transcritos (spliceossomo) snoRNA (small nucleolar): modificação do rRNA miRNA (micro): regulação da expressão gênica siRNA(small interfering): defesa do genoma contra vírus e transposons Não traduzidos: tRNA (15%) rRNA (70%)

44. O que são microRNAs? • Pequenos RNAs endógenos fita simples não codificadores de proteínas, com tamanho de ~ 19-25 nt • Ambrosetal (1993): descobriram o gene lin-4 (small non-protein-coding RNA)  regulação do desenvolvimento larval de Caenorhabditiselegans • Potentes reguladores pós-transcricionais. • Função: • -proliferação • -diferenciação • -apoptose • -carcinogênese: duplo papel (oncogênese e supressor tumoral)

45. as formas maduras são designadas miR e um único número de identificação • Ex: miR-1, miR-89, miR-278 • designado a espécie: hsa-miR-101 (in Homo sapiens) mmu-miR-101 (in mouse) • Os precursores miRNA (pré-miRNA) têm habitualmente a designação mir • Os genes que codificam os miRNA são também denominados com o mesmo prefixo de três letras com letras maiúsculas, hifenização (-) e itálico, consoante dos organismos • Ex: MIR -156 no Aribdopsis e mir-1 na Drosophila. • miRNA maduros cuja sequência difere em uma ou em duas posições são designados com sufixos com letras pequenas, • Ex: miR-1a e miR-1b NOMENCLATURA dos miRNA Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34

46. Biogênese do microRNA Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:2859–2871 Gene miRNA (localizado em introns e região intergênica) miRNA: gerado pela transcrição de um longo precursor (pri-miRNA)  pela RNA pol II processado para produzir um segundo precursor (pre-miRNA) 60-100 nt. Transportado (Exportina 5)  citoplasma processado RNase III(Dicer)  remoção hairpin miRNA duplex (~22nt)  complexo RISC  fita simples linear Ligação 3’UTR RNAm  inibição tradução Sequência seed: região de 2-8nt do final 5’ do miRNA,

47. Mecanismos de Regulação pelos miRNA Três processos: 1- clivagem endonucleolítica: requer complementaridade perfeita ou quase perfeita ao mRNA (raro em mamíferos, devido interação incompleta entre miRNA-mRNA) 2- degradação do mRNA por deadenilação: repressão da tradução da proteína; 3- inibição do início da tradução

48. NATURE|Vol 457|22 January 2009|doi:10.1038/nature07758 MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICO • Mecanismos: ligação naregião 3’UTR do RNAm (a) • pós-transcricional(PTGS): • clivagem direta do RNAm: miRNA é complementar ao RNAm degradado após clivagem p/RISC • -repressão da tradução e degradação RNAm: miRNA com pareamento incompleto DGCR8: cofator de DROSHA XPO5: exportinA-5 (transporte ao citoplasma) RISC (RNA-induced silencing complex)

49. ANIMAÇÃO miRNA - NATURE http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

50. REGULAÇÃO POR miRNA • 1 miRNA pode regular ~200 mRNA (múltiplos alvos) • 1/3 dos genes estão sob controle dos miRNA. Ex.: genes de fatores de transcrição • Genes de miRNA: banco de dados www.sanger.ac.uk/ • www.mirbase.org • ~2578 miRNA em humanos • 70% dos genes de miRNA localizados em introns e exons • 30% localizados em regiões intergênicas