Cultivos celulares y sus aplicaciones

1. Cultivos celulares y sus aplicaciones Instituto de Oncología “Angel H. Roffo” Área de Investigación Dpto. Biología Celular

2. El cultivo celular Téc. Alicia Rivelli

3. Breve introducción histórica • En 1907 el Dr. Harrison cultivó células del tubo neural de embrión de rana • En 1910 el Dr. Burrows cultivó explantos de tejido de embrión de pollo y junto con el Dr.Carrel fueron los primeros investigadores en intentar cultivo de células de mamíferos. • Entre 1940-1945 se logran replicar virus sobre células cultivadas. • En 1952 se establece la línea celular HeLa (primera línea celular de origen humano) • Durante la década del 70 los cultivos celulares se incorporan a la ingeniería genética. • En 1975 los Drs. Koehler y Milstein establecen la primera línea celular productora de anticuerpos monoclonales. • En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo celular a permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos implicados en procesos intra e intercelulares.

4. ¿Para qué cultivar células in vitro? • ESTUDIOS DE INVESTIGACIÓN: comprender la fisiología celular, toxicología, y virología. • INGENIERIA DE TEJIDOS: transplantes , injertos (piel, hígado, hueso, cartílago). • PRODUCCIÓN DE BIOLOGICOS: anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales (polio, aftosa, moquillo etc.) • CITOGENÉTICA:estudios cromosómicos. • TRANSGENICOS: organismos genéticamente modificados.

5. Diferentes tipos de cultivos de tejidos: • Cultivo de órganos: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro (por ejemplo corazón). • Cultivo de tejidos y explantes: mantenimiento de tejidos in vitro. • Cultivo de células

6. Cultivo de células: • Se define como el conjunto de técnicas de aislamiento de células y obtención de poblaciones celulares in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

7. Diferentes tipos de cultivos celulares Primario: iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo. Líneas celulares: se origina del cultivo primario, a partir del primer subcultivo exitoso. Línea celular continua: células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.

8. Cultivo primario: • Pasos: • Aislamiento del tejido de interés. • Disociación mecánica y enzimática del tejido • Obtención de la suspensión celular. • Siembra en soporte adecuado para la proliferación en monocapa o en suspensión.

9. Subcultivos • Una vez que el cultivo alcanza la confluencia (máxima proliferación posible en el soporte en que se encuentra), es necesario tomar una porción células y transferirlas a un nuevo soporte (repique o pasaje).

10. Crecimiento celular: En monocapa Las células crecen En suspensión

11. Células en monocapa • Los cultivos cuyas células son dependiente de anclaje crecen formando monocapas de células adheridas al plástico o vidrio. • Para despegar las células se utilizan enzimas que disgregan la matriz extracelular como la tripsina y la colagenasa.

12. Células en monocapa

13. Células en suspensión • Las células que proliferan sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje (característico de células hematopoyéticas) crecen en suspendidas en el medio de cultivo correspondiente. • El repique se realiza mediante una dilución de la suspensión celular.

14. Líneas celulares continuas BHK: fibroblastos de riñón hámster cirio dorado. CrFK: fibroblasto de riñón gato doméstico. MDCK: epitelio de riñón canino. CHO: epitelio de ovario de hámster chino. HeLa: epitelio tumoral de cuello uterino humano. MDBK: epitelio de riñón adulto. HUVEC: endotelio de vena umbilical humana

15. Línea celular LM3 • Línea celular establecida a partir de pasajes sucesivos in vitro de un cultivo primario del adenocarcinoma mamario murino M3. • El adenocarcinoma mamario M3 surgió espontáneamente en una ratona BALB/c endocriada en el bioterio del Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo”. • Las células LM3 presentan un fenotipo altamente invasivo y metastásico al ser inoculadas en ratones singeneicos y en cultivo muestran una morfología epitelial poliédrica

16. ABAC Asociación Banco Argentino de Células Desde 1987 mantiene y administra líneas celulares en distintos centros de investigación, proveyendo células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel.

17. Mantenimiento de líneas celulares • Repique o pasaje: para mantener las células en cultivo. • Congelación (criopreservación): para preservar las células a lo largo del tiempo (años) y mantener un stock para los próximos usos.

18. Criopreservación • Técnica: • Se levanta la monocapa por tripsinización • Se obtiene una suspensión celular. • Se centrifuga 800-900 rpm durante 10 min, para separar la fracción celular del medio de cultivo. • El pellet celular se resuspende en medio de congelación (SFB o medio enriquecido mas DMSO o Glicerol –anticongelantes-)

19. Criopreservación • Se fraccionan en criotubos. • Colocar en recipiente adecuado 20 minutos en heladera y luego se la lleva a freezer -80°C durante 24-48 hs • Se guardan en tanque de nitrógeno líquido

20. Componentes del medioambiente del cultivo: Medio de cultivo:( aporta nutrientes, vitaminas etc.) Suplementos: (ej suero que aporta factores de crecimiento) pH: ( ej: 7,4 ) Temperatura: (ej. 37° C) Gas: Dióxido de carbono (ej. 5-7%) Soportes: materiales adecuados para el crecimiento (ej vidrio, plástico, biológicos etc.)

21. Medios de cultivo

22. Suplementos

23. Atmósfera y temperatura • Estufa de cultivo con atmósfera de Dióxido de carbono

24. Soportes • Estériles • Generalmente se utiliza material de plástico:

25. Soportes • Biológicos:

26. El laboratorio de cultivo celular • Además del equipamiento usual se requiere: • Microscopios: invertido con contraste de fase, de fluorescencia, etc.

27. El laboratorio de cultivo celular • Flujo Laminar o campana de seguridad biológica: mantienen la esterilidad del área de trabajo.

28. El laboratorio de cultivo celular • Espacios fríos: • Heladeras (4°C) • Freezer (-20, -40,-80 °C) • Tanque de Nitrógeno Liquido (- 196°C)

29. El laboratorio de cultivo celular

30. Factores críticos • No biológicos: orden, limpieza, vestimenta adecuada para cada sector, etc. • Biológicos: CONTAMINACIONES La contaminación puede ser visible o no, destructiva o no, pero en todos los casos tiene efectos adversos

31. Contaminaciones Biológicas • Microorganismos: Bacterias Hongos/Levaduras Mycoplasmas • Otras células

32. Contaminaciones Biológicas • Efectos adversos sobre el metabolismo celular • Pobre calidad de resultados experimentales • Pérdida de células valiosas • Pérdida de productos celulares (por ejemplo producción de antígenos para vacunas, etc.) • Pérdida de tiempo, dinero y esfuerzo

33. MUCHAS GRACIAS!!!

34. Aplicaciones en Oncología Téc. Silvina Romero Instituto de Oncología “Angel H. Roffo”

35. Aplicaciones de los cultivos celulares en la Investigación en cáncer

36. Investigación en Oncología • Se realizan ensayos tendientes a: • Caracterizar el comportamiento de las células tumorales in vitro e in vivo. • Revertir la agresividad tumoral mediante drogas y herramientas genéticas tanto in vitro como in vivo.

37. Introducción • El cáncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de células, con crecimiento y división más allá de los límites normales, invasión del tejido circundante y, a veces, metástasis. • La metástasis es la propagación a distancia de las celulas tumorales, por vía linfática o sanguínea, lo que implica el crecimiento de nuevos tumores en un lugar diferente al tumor original (primario). • Estas propiedades diferencian a los tumores malignos de los benignos, que son limitados y no producen metástasis.

38. Celulas normales vs tumorales Células normales Células tumorales

39. Características de las células tumorales • Forma (pleomorfismo): cambio de en la morfología y tamaño del citoplasma. • Adhesión/ Movilidad: la reducción de la adhesión entre células y con la matriz celular facilita la movilidad celular favoreciendo la aparición de metástasis • Cambios en el citoesqueleto: estos cambios afectan:

40. Características de las células tumorales • Cambios nucleares: tiene valor diagnóstico • Número: celulas multinucleadas • Forma: mas grandes o mas pequeños • Organización de los núcleos: (nucleolos prominentes) • Hipercromasia: por la presencia de mayor cantidad de ADN.

41. Características de las células tumorales • Producción de enzimas proteolíticas: permiten invadir los tejidos adyacentes facilitando la migración y la propagación de las células tumorales.

42. Características de las células tumorales • Grado de diferenciación celular: las células neoplásicas por su alta tasa de proliferación se desdiferencian pareciéndose al tipo celular que le dio origen. • Alteraciones en el crecimiento: crecen de manera desordenada, pierden la polaridad celular y no respetan límites por contacto célula-célula. • Resistencia a la apoptosis: muerte celular programada

43. Biología Molecular del Cáncer • La transformación maligna implica la adquisición progresiva de una serie de cambios genéticos y bioquímicos específicos que actúan desobedeciendo los fuertes mecanismos antitumorales presentes en las células normales.

44. Investigación en Oncología • Se trabaja con dos modelos • Celulares: Líneas celulares cancerígenas (in vitro) • Animales de experimentación: Ratones (in vivo) a los cuales por inyección de la celulas tumorales se les genera la enfermedad experimentalmente.

45. Estudios in vitro

46. Investigación en Oncología • Lineas celulares tumorales usadas en nuestro laboratorio. • LM3 : Ca mamario murino • MCF7: Ca mamario humano • MB49: Ca de vejiga murino • T24: Ca de vejiga humano • LP07: Ca de pulmón murino • Entre otras…

47. Estudios celulares

48. Estudios celulares: • Morfológicos • Funcionales • Mixtos • Cromosómicos

49. Estudios Morfológicos: • Observación en fresco o post fijación (formol neutro) de monocapas celulares, en microscopio óptico invertido, contraste de fase, fluorescencia etc.

50. Estudios funcionales: • Viabilidad celular • Adhesión * • Ensayos clonogénicos* • Migración* • Actividad enzimática* • Citotoxicidad *evalúan la capacidad invasiva y metastásica.