Eiwitten in het nieuws

1. Eiwitten in het nieuws

2. Adenosine-receptor • http://www.c2w.nl/terug-naar-de-tekentafel.51851.lynkx • http://esciencenews.com/articles/2008/10/02/many.receptor.models.used.drug.design.may.not.be.useful.after.all • Nu 3D-structuur van drie receptoren van de 800 die we hebben… • Belangrijk voor medicijnonderzoek (Parkinson, ….)

3. Green Fluorescent Protein • Nobelprijs Scheikunde 2008 • http://www.c2w.nl/nobelprijs-voor-groen-eiwit.56537.lynkx • http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ • http://www.ecosci.jp/chem10/gfp.html

5. Studietaak 3 Post-translationele modificaties Signals in sequences

6. Signals in sequences • Eiwitten: meer dan alleen aminozuren • Post-translationele modificaties • ‘Signaal’ hiervoor in az-volgorde! • Voorspellingen over de structuur en/of functie van eiwitten • Op basis van die signalen

7. Post-translationele modificaties

8. Post-translationele modificaties • Aanpassingen na afloop van (= ‘post’) translatie • Extra ‘groepen’ die aan eiwitten worden gezet • Invloed op o.m. vorm en functie van het eiwit • Ken je zelf voorbeelden? • Proteolytische klieving • Protein sorting / protein targeting (pre-sequenties) • Van inactief pro-eiwit naar actief eiwit (pro-sequenties)

9. Signaaltransductie

10. EPO: geglycosileerd eiwit

11. Afsplitsing van aminozuren of peptiden

12. Afsplitsing van aminozuren of peptiden • Gebeurt door proteolytische enzymen • Specifiek (herkenningssequentie)

13. Trypsine activeert andere zymogenen • Trypsine is de algemene activator van alle pancreatische zymogenen (pro-enzymen)

15. Elk organisme bezit proteolytische enzymen • Er zijn verschillende klasses proteolytische enzymen (ter info, niet kennen!) • Allerlei functies • Elk protease/proteïnase/peptidase heeft zijn eigen substraatspecificiteit = herkenningsplaats & klievingsplaats: alleen bepaalde aminozuurvolgordes! (straks meer)

16. Activatie van proteases • Een aantal proteases is betrokken bij het activeren van pro-eiwitten (zoals pro-insuline) • Maar proteases worden zelf ook meestal gesynthetiseerd als pro-eiwitten • Op de plaats van bestemming (bv. buiten de cel bij een bacterie of in het darmlumen bij de prancreatische proteases) wordt het pro-gedeelte afgesplitst (meestal door weer een ander protease) en wordt het protease actief

17. Proteolytische enzymen in het biochemisch onderzoek 1: Bepaling van de aminozuursequentie van een eiwit

18. Bepaling van aminozuursequentie gebeurt tegenwoordig in 99,9% van de gevallen via DNA-technologie (HOE?), maar vroeger kon dat niet….

19. Ouderwetse bepaling van de az-sequentie • Pehr Edman ontwikkelde een methode voor het labelen van de N-terminus van een peptide, gevolgd door klieving ervan van het peptide • Deze methode heet Edman-degradatie • Door dit achter elkaar te doen en elke keer het gelabelde en vervolgens afgekliefde aminozuur te identificeren (mbv HPLC) kan de aminozuursequentie van peptiden tot ca. 50 az worden bepaald

21. Ouderwetse bepaling van de az-sequentie • Een tweede manier is om vanaf de C-terminus steeds een aminozuur af te klieven m.b.v. carboxypeptidase en dit steeds te identificeren

22. Ouderwetse bepaling van de az-sequentie • Langere polypeptides moeten eerst in kleinere stukjes worden ´gehakt´ m.b.v. proteases of cyanogeenbromide (CNBr) • Bijvoorbeeld:

23. Sub-peptides Polypeptide • Behandeling van een polypeptide met trypsine

24. De az-volgorde van de sub-peptides is onbekend! De sequentie wordt gereconstrueerd d.m.b. de overlap tussen op verschillende manieren geproduceerde sub-peptides Trypsine (lys, arg) (1) Chymotrypsine (trp, tyr, phe) N C (2) Az-volgordes bepalen van de geproduceerde peptides 

25. Oefenen • Ik heb een klein peptide van negen az • Na incubatie van dit peptide met trypsine (R K) vind ik twee peptides met de volgende az-volgordes: • AAWGK • TYVK • Na incubatie van hetzelfde peptide met chymotrypsine (Y W F) vind ik een peptide met de volgende az-volgorde: • VKAAW • De overige brokstukken cq losse az van de incubatie met chymotrypsine zijn te klein om te isoleren en deze zijn dus niet bepaald! • Wat is de az-volgorde van dit peptide?

26. Nog meer oefenen • www.bioplein.nl

27. Protein Targeting

28. Protein Targeting • Bij prokaryoten zijn er niet zoveel verschillende locaties om een eiwit naar toe te sturen • Welke? • Eukaryote cellen hebben organellen en dus veel meer locaties om eiwitten naar toe te sturen

29. Prokaryoten: bekendste systeem: Sec-systeem

30. Protein Targeting bij eukaryoten • Twee ‘soorten’ ribosomen: • Vrije ribosomen: maken eiwitten die in het cytosol zitten • Aan ER gebonden ribosomen (‘ruw ER’) maken eiwitten voor endomembraansysteem ( organellen) en eiwitten die uitgescheiden worden • Aan kernmembraan gebonden ribosomen maken eiwitten die in celkern terecht moeten komen • Eiwitten voor endomembraansysteem of buitenkant: na synthese van N-terminaal signaalpeptidebinding aan SRP (= signal-recognition particle) • SRP met peptide en ribosoom aan SRP receptor op het ER; verwijdering van signaalpeptide

31. Protein Targeting bij eukaryoten • Na koppeling ribosoom aan ER gaat synthese verder en eiwit komt in lumen ER terecht • Daar blijft het of het wordt verder getransporteerd • Zo zijn er ook signaalsequenties (‘postcodes’) voor mito’s, chloro’s, kern en andere organellen die geen deel uit maken van het endomembraan-systeem • Hierbij wordt het eiwit eerst helemaal gemaakt in het cytosol en vervolgens naar het organel geïmporteerd

32. http://www.steve.gb.com/science/protein_targeting.html

37. Signaalsequenties • De ‘postcodes’ van de cel • Meer op www.bioplein.nl

38. Extra groepen aan eiwitten

40. Extra groepen aan eiwitten • Glycosylering • Acylering • Myristoylering • Methylering • Fosforylering • Sulfering • Prenylering • Hydroxylering • Amidering • Carboxylering • …..

41. Glycosylering

42. . Een glycoproteïneis een eiwit met daaraan covalent gebonden een of meer koolhydraat-moleculen (ook wel glycanen genoemd). Het kan hierbij gaan om monosacharide(s), disacharide(s), oligosacharide(s), polysacharide(s) of afgeleiden hiervan (bv. sulfo- of fosfo-gesubstitueerd). Het kan gaan om één, enkele of veel koolhydraten per eiwit.

43. De meeste modificaties bij glycoproteïnen vinden plaats via N- of O-glycosidische bindingen O-linkage: Ser, Thr (GalNAc) N-linkage: Asn (GlcNAc) • ~ 50% van alle eukaryote eiwitten is geglycosyleerd • Hiervan is 90% N-linked glycanen • Het vaakst worden de volgende monomere suikers aangetroffen: glucose, galactose, mannose, fucose, GalNAc en GlcNAc

44. Eiwit-glycosylering vindt plaats tijdens het transport in ER en Golgi • Dus alleen eiwitten die via deze route gaan worden geglycosyleerd! (waar kun je dus geglycosyleerde eiwitten verwachten en waar niet??) • De glycosylering is belangrijk voor de vouwing en de functie van het eiwit

46. Cutis laxa: Een van de aandoeningen die het gevolg zijn van een glycosyleringsdefect

47. Hoe toon je aan of er bij een patiënt sprake is van een glycosyleringsdefect? • N-glycosylering: Isoëlektrische Focusering (IEF) van transferrine • Transferrine in bloed • Geglycosyleerd eiwit • Afwezigheid of verstoring glycosylering a.g.v. algemeen glycsoyleringsdefect leidt tot afwijkend Isoëlektrisch Punt (IEP) van transferrine • Sinds kort ook een klinische test voor O-glycosyleringsdefecten dankzij oud-studente Suzan Wopereis

49. Voorspellingen Meer in de computerles

50. Voorspellingen • Voorspellingen over de structuur en/of functie van eiwitten gebaseerd op: • Vergelijken van eiwitten • De aminozuurvolgorde van het eiwit zelf • Signalen in aminozuursequenties