1 / 40

Metode istraživanja u histologiji

Metode istraživanja u histologiji. Livia Puljak Katedra za histologiju i embriologiju. Zašto se uči histologija. Učenje mikroskopske građe ljudskog tijela Razumijevanje načina na koji različita tkiva funkcioniraju – temelj za fiziologiju

tarika
Download Presentation

Metode istraživanja u histologiji

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metode istraživanja u histologiji Livia Puljak Katedra za histologiju i embriologiju

  2. Zašto se uči histologija • Učenje mikroskopske građe ljudskog tijela • Razumijevanje načina na koji različita tkiva funkcioniraju – temelj za fiziologiju • Da bi znali kako izgleda bolesno tkivo, moramo znati kako izgleda zdravo – temelj za patologiju • Histologija je važna za moderna znanstvena polja: apoptoza stanice, prepoznavanje stanice, implantacija embrionalnih matičnih stanica, itd. • Histologija je temelj za kliničke znanosti

  3. Mikro-morfologija tkiva

  4. Proučavanje tkiva • Uobičajeni postupak: pripravljanje histoloških rezova • Promatranje svjetlosnim mikroskopom • Tkiva i organi su debeli • Treba ih rezati da kroz njih može prolaziti svjetlo • Moguće je promatrati žive stanice • Tanki slojevi tkiva • Ipak, najčešće se tkiva mogu proučavati tek nakon što se izrežu na tanke rezove koji se prilijepe na stakalca

  5. Idealan histološki preparat • Pripravak tkiva očuvan • Tkivo na stakalcu ima jednaku građu i molekularni sastav kakvo je imalo u tijelu • Rijetko izvedivo u praksi • Na pripravku gotovo uvijek ima • Artefakata • Deformacija • Gubitaka sastojaka Nabor na preparatu hrskavice

  6. Priprema histoloških rezova • Uzimanje i obrada tkiva ili stanica • Fiksiranje/smrzavanje tkiva • Uklapanje tkiva • Rezanje tkiva mikrotomom ili kriostatom • Bojanje tkiva • Analiza

  7. Fiksacija • Za pripremu trajnih preparata • Da se izbjegne razgrađivanje tkiva • Enzimima • Bakterijama • Nužna brza i prikladna fiksacija • Kemijske i fizikalne metode fiksacije

  8. Kemijska fiksacija tkiva • Otopine tvari (fiksativi) • Stabiliziraju ili križno povezuju tkivne bjelančevine • Rezanje i umakanje tkiva u otopinu • Intravaskularna perfuzija • Ubrizgavanje fiksativa u krvožilni sustav

  9. Kemijski fiksativi • Križno povezivanje bjelančevina • Aldehidi • Precipitirajući fiksativi • Alkohol • Oksidirajuće tvari • Osmijev tetraoksid, kalij dikromat, kromna kiselina, kalij permanganat • Živini spojevi • Pikrati • HOPE fiksativ

  10. Fizikalna fiksacija tkiva • Fiksacija toplinom • Kad se bris osuši na sobnoj temperaturi • Preparat se nekoliko puta prinese plameniku • Rutinski se koristi za bakterije • Čuva morfologiju, ali ne interne strukture • Toplina: • denaturira proteolitičke enzime • spriječava autolizu

  11. Postupak uklapanja ili impregniranja tkiva • Dehidriranje • Uklanja se voda • Uzastopnim prenošenjem u sve koncentriranije mješavine etanola i vode • Zamjena etanola otapalom za sredstvo za uklapanje • Za vrijeme prožimanja otapalom tkivo obično postane prozirno (prosvjetljivanje) • Uklapanje u otopljeni parafin u termostatu • Van termostata: • tkivo proženo parafinom se stvrdne

  12. Uklapanje tkiva • Tkivo se može rezati tek kad se uklopi u neko čvrsto sredstvo • Za rezanje mikrotomom – plastične smole i parafin • Za rezanje smrznutih rezova – uklapanje u poseban medij koji se brzo smrzne

  13. Tkiva uklopljena u parafinu i spremna za rezanje i postavljanje na stakalca

  14. Rezanje tkiva • Rezanje tkiva točno određene debljine • Mikrotom • Nužna prethodna složena priprema tkiva • Kriotom • Smrznuti rezovi, jednostavna priprema tkiva Mikrotom Kriotom

  15. Smrznuti rezovi • Brza metoda • Bez prethodnog dugog postupka uklapanja • Rutinska primjena u bolnicama za pregledavanje tkiva tijekom kirurškog zahvata • Korisno u histokemijskom istraživanju vrlo osjetljivih enzima i malih molekula • Za proučavanje tkivnih lipida

  16. Bojenje • Tkiva su uglavnom bezbojna • Stoga nije moguće svjetlosnim mikroskopom proučavati neobojena tkiva • Bojenjem se ističu pojedini sastojci tkiva • Bazofilne boje • Acidofilne boje • Trikromi • Kontrastno bojenje

  17. Hematoksilin i eozin Jednjak Hematoksilin boji bazofilne sastojke tkiva, a eozin boji acidofilne sastojke

  18. Trikromi Trikromi dobro prikazuju jezgru i citoplazmu, a različito oboje kolagen i glatko mišićje

  19. Kontrastno bojenje • U mnogim postupcima (npr. imunocitokemija) pojedinosti na rezovima označavaju se nekim precipitatom • Ali tada se ne vide obrisi stanica • Kontrastno bojenje, jednom bojom, omogućuje blijedo bojenje jezgre i citoplazme • Slika: crveno je bojenje za protein CD61, a plavo je kontrastno bojenje jezgre

  20. Svjetlosni mikroskop • Zasniva se na uzajamnom djelovanju svjetla i tkivnih sastojaka • Najvažniji preduvjet za dobivanje jasne slike jest moć razlučivanja mikroskopa

  21. Polarizacijski mikroskop Omogućuje prepoznavanje tvorba građenih od vrlo pravilno poredanih molekula

  22. Slika preparata snimljenog na polarizacijskom mikroskopu Štakorski mezenterij obojen pikrosirijusom za prikazivanje kolagenih vlakana. U polariziranom svjetlu kolagena su vlakna obojena sjajno crveno ili žuto Polarizacijski mikroskop omogućuje prepoznavanje tvorba građenih od vrlo pravilno poredanih molekula

  23. Konfokalni mikroskop Omogućuje veoma točno fokusiranje na sasvim tanku ravninu unutar stanice ili histološkog reza

  24. Slika preparata snimljenog na konfokalnom mikroskopu Mreža aktinskih vlakana u glatkom mišiću dijafragme štakora

  25. Slika preparata snimljenog na fluorescencijskom mikroskopu Fibroblasti maternice. Bojanje s 3 različite fluorescentne boje. Fluorescencijski mikroskop sadrži izvor ultraljubičastog svijetla i posebne filtre za odabir svjetlosnih zraka različitih duljina

  26. Elektronski mikroskop • Dopušta povećanja od 400 000 puta • Transmisijski EM (na slici) • Snop elektrona prolaze kroz preparat • Skenirajući (scanning) EM • Omogućuje prikaz naizgled trodimenzionalne slike • Uski snop elektrona polagano klizi na površini preparata (skenira)

  27. Slika preparata snimljena na TEM Crijevni mikrovili

  28. Slika preparata snimljena na SEM Leukociti u krvnoj žili

  29. EM slike mogu se računalno obojati Jajna stanica

  30. Ako su tkiva dobro obrađena i fiksiranamogu se uspoređivati kontrolna tkiva obojena H&Esa onima koja su patološki promijenjena i utvrditi razlike

  31. Artefakt: pukotina u tkivu Artefakt: nabor tkiva Artefakt: znak noža i nabor

  32. Proučavanje histoloških preparata Pregledati cijeli preparat Presjek – poprečni ili uzdužni Povećanje – veliko, srednje ili malo Na mnogim preparatima je teško točno utvrditi za sve stanice koje su – nemojte se stoga frustrirati

  33. Presjek – uzdužni, poprečni, kosi

  34. Ponekad se na istom preparatu vide različiti presjeci kroz istu vrstu tkiva

  35. Ako nema informacije o povećanju, treba utvrditi je li malo, srednje ili veliko Hint: Malo povećanje – puno stanica, veliko povećanje – malo stanica

  36. Usporedba zdravog i bolesnogHistologija - Patologija Blokirana koronarna arterija

  37. Emfizem pluća

  38. Anemija srpastih stanica

  39. Upala mliječne žlijezde zbog curenja silikona

  40. Čir želuca

More Related