Etude multicentrique prospective des prélèvements positifs à bacilles à Gram négatif non fermentaires (BGN-NF)

1. Etude multicentrique prospective des prélèvements positifs à bacilles à Gram négatif non fermentaires (BGN-NF) Données microbiologiques Hervé Jacquier, Stéphane Corvec, Alban Le Monnier, Emmanuelle Bille, Françoise Jauréguy, Etienne Carbonnelle, Vincent Fihman, Jacques Tankovic, Vincent Cattoir

2. Bacilles à Gram négatif non fermentaires • Habitat • Environnement • Eau • Pathogénicité • Colonisation / Infection ? • Facteurs de risque • Immunodépression • Mucoviscidose • Immunocompétent • Service de réanimation • Traitement antibiotique préalable • Ventilation mécanique • BPCO • Résistance aux antibiotiques +++

3. Identification des BGN-NF • Microbiologie « conventionnelle » • Gram, mobilité, phénotype de résistance, oxydase… • Systèmes d’identification commerciaux • Galerie API 20NE • Carte VITEK 2 ID-GNB • Phoenix ID • Microscan… → Identification parfois peu fiable et limitée au genre → Apport de la biologie moléculaire

4. Identification des BGN-NF • Biologie moléculaire • Séquençage du gène rrs (gène codant l’ARN16S) • « Gold Standard » • Bonne discrimination ? • Autres cibles • gyrB chez Aeromonas (Küpfer, et al., IJSEM, 2006) • rpoB et ses régions flanquantes chez Acinetobacter (La Scola, et al., JCM, 2006) →Méthodescoûteusesetlongues →ApportdelaspectrométriedemasseMALDI-TOF

5. Spectrométrie de masse MALDI-TOF • Utilisation en routine à évaluer • Seng et al., CID 2009 : • 1660 isolats étudiés • 95,4% d’identification : 84,4% à l’espèce et 11,1% au genre • Cas particuliers • Staphylocoques à coagulase négative (Carbonnelle et al., JCM, 2007) • Streptocoques oraux (Friedrichs et al., JCM, 2007) • Anaérobies (Nagy, et al., CID, 2009) • BGN-NF isolés de patients atteints de mucoviscidose (Degand et al., JCM, 2008)

6. Objectifs • Etude de l’épidémiologie des prélèvements cliniques positifs à BGN-NF • Application de la spectrométrie de masse MALDI-TOF dans l’identification des BGN-NF en routine

7. Matériels et méthodes • Recueil des souches • Etude prospective : décembre 2008 - mai 2009 • Etude Multicentrique : 9 hôpitaux APHP et de Province • Souches inclues : BGN-NF (hors P. aeruginosa et A. baumannii) isolés de prélèvements à visée diagnostique • Prélèvements • Prélèvements cliniques : hémocultures, cathéters, prélèvements respiratoires (y compris de mucoviscidose), urines et abcès profonds • Identification • Systèmes d’identification commerciaux : • Galerie API 20 NE • Carte Vitek2-GNB • Séquençage du gène codant l’ARN 16S : Gold Standard • Amorces A2/S15  1390 pb (P. Grimont, CIMB Pasteur) • Spectrométrie de masse MALDI-TOF

8. Matériels et méthodesSpectrométrie de masse MALDI-TOF • Laboratoire de microbiologie - Hôpital Necker • Conditions de culture préalable • Culture sur Müeller Hinton Agar à 37°C • Spectromètre de masse MALDI-TOF • Microflex Bruker • Voltage 20kV • m/z = 2000  20000 • 200 impacts

9. Spectrométrie de masse MALDI-TOF • Degand et al., JCM, 2008

10. Résultats Epidémiologie des prélèvements cliniques positifs à BGN-NF

11. RésultatsPrélèvements • Prélèvements : n= 181 15,9% 39% 13,2% 14,9% 17%

12. RésultatsPrélèvements • Prélèvements : n= 181 • Prélèvements mono/plurimicrobiens • 54% des prélèvements monomicrobiens • Prélèvements profonds / Superficiels • 70% de prélèvements profonds • Prélèvements pulmonaires • 1/3 mucoviscidose • 2/3 non-mucoviscidose • Recrutement multicentrique : diversité

13. Résultats • Nombre de souches recueillies : n=182 • Diversité : 36 espèces différentes • Espèces prédominantes • Stenotrophomonas maltophilia n=71 (39%) • Achromobacter xylosoxidans n=24 (13,2%) • Pseudomonas putida group n=17 (9,3%) • → 3 espèces représentent > 50% des souches

14. RésultatsPrélèvements respiratoires Patients non mucoviscidose n=53 n=12 n=29 n=2 n=10 n=2 Patients mucoviscidose n=19 n=5 n=4 n=8

15. RésultatsHémocultures et ECBU • Hémocultures (n=30) • Diversité : 15 espèces différentes • Espèces prédominantes • Stenotrophomonas maltophilia n=7 (23,3%) • Pseudomonas putida group n=6 (20%) • Urines (n=27) • Diversité : 11 espèces différentes • Espèces prédominantes • Stenotrophomonas maltophilia n=7 (25,9%) • Pseudomonas putida group n=7 (25,9%)

16. Résultats Identification Application de la spectrométrie de masse MALDI-TOF

17. 11,6% 12% 9,4% 73,8% 81,9% 87,6% RésultatsDifférentes méthodes d’identificationn=172 souches 97,1%

18. 19,8% 21% 16% 55,4% 68,4% 79% RésultatsDifférentes méthodes d’identificationn=101 souches(S. maltophilia exclus) 95%

19. RésultatsAnalyse des résultats de MALDI-TOF • Absence d’identification (n=4): • Comamonas kerstersii • Kerstersia gyiorum • Psychrobacter phenylpyruvicus • Shewanella algae • Erreur d’identification (n=1): • Identification rendue Alcaligenes faecalis pour un Roseomonas mucosa

20. RésultatsIdentification limitée au genre n=16

21. Discussion • BGN-NF : • Limites Colonisation / Infection ? • Classification changeante • Impact taxonomique • Impact clinique ? • Gène rrs : le bon « Gold Standard » ? • MALDI-TOF : technique prometteuse • Rapidité • Coût • Identification dans 97,1% des cas • Dynamique de la base de données

22. Remerciements VincentCATTOIR Jocelyn MICHON Michel AUZOU CHUCaen Hôpital Necker Enfants Malades Pr Xavier NASSIF Emmanuelle BILLE Jean-Ralph ZAHAR Jean-Luc BERETTI Brunhilde DAUPHIN Julie MEYER Julie LETO Françoise JAUREGUY CHUAvicenne Alban LE MONNIER CH Versailles Etienne CARBONNELLE JonathanRAMAHEFASOLO CHUHEGP Stéphane CORVEC Marina ILLIAQUER CHUNantes Vincent FIHMAN CHULouis Mourier Marie-José SANSON-LE-PORS Laurent RASKINE CHULariboisière Jacques TANKOVIC CHUSaint-Antoine

23. MERCI DE VOTRE ATTENTION

24. RésultatsRépartition par service