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Enzimas de restricción y electroforesis. Enzimas de restricción. Son endonucleasas específicas capaces de reconocer secuencias palindrómicas de DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del material genético en un punto específico.
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Enzimas de restricción • Son endonucleasas específicas capaces de reconocer secuencias palindrómicas de DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del material genético en un punto específico. • Palindrómicas quiere decir que leen en direcciones opuestas el mismo orden de nucleótidos. 5’ G T T A A C 3’ 3’ C A A T T G 5’
Tipos de endonucleasas • Endonucleasa Tipo I – corta lejos de la sucuencia que reconoce, ya sea río arriba o río abajo. • Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la secuencia que reconocen. • Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.
Enzimas de restricción • Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc. • Estas enzimas se obtienen de células bacterianas. • El nombre de estas está dado según el género y la especie de la bacteria de dónde se aisló por primera vez esta enzima. • La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, la cuarta letra indica la cepa y el número al final indica el número de enzima que se ha aislado de esa cepa.
Enzimas de restricción • Por ejemplo: EcoRI • Otros ejemplos: • BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens • SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens • HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de Haemophilus influenzae Primera enzima aislada de ese organismo. Escherichia (género) coli (especie) cepa R
Tipos de corte • “Sticky” o pegajosos – es más fácil para volver a ligarse los extremos. • Ejms. • EcoRI • Bam HI • HindIII • “Blunt” o abruptos • Ejm. • SmaI
Enzimas de restricción • Las endonucleasas son de gran importancia para la ingeniería genética, ya que permiten desarrollar técnicas de clonación. • Además, te permite realizar mapas de restricción y determinar si existe homología entre otras moléculas de DNA.
Electroforesis • Se define como el movimiento de partículas de carga bajo la influencia de un campo eléctrico a través de un medio semisólido. • Este medio puede ser de agarosa o de poliacrilamida.
Electroforesis • El DNA es de carga negativa, por lo que las partículas migran del electrodo negativo (cátodo) al electrodo positivo (ánodo). • Esta migración es inversamente proporcional al peso molecular de las muestras.
Electroforesis • Materiales necesarios para llevar a cabo una electroforesis: • Gel de agarosa – generalmente se utiliza de 1% - 2% de agarosa. • Cámara de electroforesis – contiene los electrodos • “Power supply” – genera el campo eléctrico
Electroforesis • Amortiguador de electroforesis - usualmente TBE 1X; facilita la migración de DNA y mantiene una estabilidad • Bromuro de etidio – compuesto carcinógeno que se entrecruza entre las moléculas de DNA y cuando se irradia con luz ultravioleta emite fluorescencia.
Electroforesis • “Loading dye” – compuesto que se añade a las muestras de DNA; contiene glicerol, que le da peso a la muestra y no permite que se salgan de la fosa, y bromofenol azul que tiñe la muestra de color azul y sirve como indicador de migración • Lámpara de UV – permite ver las bandas generadas • Cámara – para tomar una foto de la gel
