Trabajo Práctico Nº4

1. Trabajo Práctico Nº4 Aislamiento de Microorganismos Diversidad Metabólica

2. Objetivo del Trabajo Práctico Aislamiento de microorganismos partir de distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra y yogurt) • Enriquecimiento-Selección • Selección-Diferenciación • Obtención de un cultivo puro (Tinción de Gram y Pruebas Bioquímicas)

3. Microorganismos a aislar: • Enterobacterias (agua) • Pseudomonas spp. (agua) • Staphylococcus spp. (ricota) • Bacillus spp. (arroz) • Lactobacillus spp. (yogurt) • Azotobacter spp. (tierra)

4. Medios de Cultivo: características generales • Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas, vitaminas) • Disponibilidad de oxígeno • pH • Humedad • Temperatura • Esterilidad

5. Medios Definidos o Complejos • Medios Mínimos (definidos) o Ricos (complejos).

6. Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones) son conocidos. • Ejemplo de Medio DefinidoparaEscherichia coli:

7. Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de desconoce (extractos, peptonas, etc). • Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:

8. Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos. • Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la caseína. • Peptona de carne: degradación pancreática de la carne. • Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina. • Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de crecimiento. • Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura autolizada. Alto contenido de vitaminas.

9. Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9. • Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia (provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios complejos. • Por ej: Luria-Bertani (LB):

10. Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de interés. • Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y queinhibenel desarrollo de otros grupos. Por ej: sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram positivos. • Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias que fermentan lactosa). • Medio Selectivo y Diferencial.

11. Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo): • Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en un caldo de enriquecimiento. • Incubar a la temperatura y tiempo adecuados. • Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial). Obtención de colonias aisladas. • Tinción de Gram • Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.

12. Enterobacterias • g-Proteobacteria • Bacilos Gram negativos • Fermentadores de glucosa • Anaerobios facultativos • Flagelos peritricos • Escherichia coli (algunas cepas patógenas) • Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella, Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas. • Oxidasa negativos

13. Aislamiento de Enterobacterias (agua) • 1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche. • Peptona de Caseína • Lactosa • Bilis de Buey • Púrpura de Bromocresol pH= 7,4±0,2 Incubar por 48 hs a 37ºC Si hay fermentación de lactosa: Sólo ácido Coliformes, sin E. coli Gas + ácido E.coli (junto a otras coliformes)

14. Aislamiento de Enterobacterias (agua) Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.

16. Aislamiento de Enterobacterias (agua) • 2. Ágar Mac Conkey: medio selectivoy diferencial. • Peptona de Caseína • Peptona de Carne • Cloruro de Sodio • Lactosa • Sales biliares • Cristal violeta • Rojo Neutro • pH= 7,1±0,1 • Incubar por 24 hs • a 37ºC

17. Ágar Mac Conkey Lactosa - Lactosa + Escherichia coli Salmonella typhimurium

18. Aislamiento de Enterobacterias (agua) • 2.Ágar EMB: medio selectivo y diferencial (enterobacterias patógenas). • Peptona de Carne • Hidrógenofosfato dipotásico • Lactosa • Sacarosa • Eosina Amarillenta • Azul de Metileno • pH=7,0±0,2 • Incubar por 24 hs • a 37ºC

19. Ágar EMB Lactosa + Lactosa + Enterobacter spp. Escherichia coli

20. Pseudomonas spp. • g-Proteobacteria • Bacilos Gram negativos • Aerobios estrictos • Con flagelos polares • Producen pigmentos • No fermentadores • Oxidasa positivos • Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos

21. Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua) • Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC: enriquecimiento y selección. • Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas aeruginosa • Peptona de Gelatina • MgCl2 • Cetrimida • Glicerina • SO4K2 • Incubar por 48 hs a 37ºC. Pseudomonas aeruginosa

22. Staphylococcus spp. • Cocos Gram positivos • Anaerobios facultativos • Fermentan glucosa (ac. láctico) • Asociados a piel y mucosas • Patógenos (S. aureus) • Resisten altas concentraciones salinas

23. Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota) • Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento(2 hs a temperatura ambiente) • Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo para Estafilococos patógenos. • Infusión de cerebro • Infusión de corazón • Proteosa peptona • D(+) Glucosa • NaCl (7.5% final) • Hidrógenofosfato disódico • pH=7,4±0,2 • Incubar por 48 hs a 37ºC • Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida

24. Aislamiento de Staphylococcus aureus • 3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas). • Peptona de carne • Extracto de carne • NaCl 7.5% • D(-)Manitol • Rojo fenol • pH=7,4±0,2 • Incubar por 48 hs a 37ºC • S. aureus • S. epidermidis • Micrococcus luteus 3. Ágar azida: medioselectivopara Staphylococcus spp. Incubar por 48 hs a 37ºC

25. Bacillus spp. • Bacilos Gram positivos • Forman endosporas • Generalmente móviles con flagelos peritricos • Aerobios (facultativos) • B. cereus (alimentos) • B. anthracis

26. Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz) • Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección. • Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento. • Incubar por 48 hs a 37ºC. • Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis) • Peptona de carne • Extracto de carne • D(-)Manitol • NaCl • Rojo Fenol • Emulsión de yema de huevo/Polimixina B • Incubar por 48 hs a37ºC. • Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado blanco (Manitol – y lecitinasa +). • Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

27. Lactobacillus spp. • Bacilos o cocobacilos Gram positivos • Fermentadores lácticos • Aerobios facultativos o microaerófilos

28. Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt) 1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento selectivo. Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso. pH = 5.7. Incubación en microaerobiosis. 2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el anterior, con mayores concentraciones de acetato y pH = 5.5 que inhiben flora acompañante. Incubación en microaerobiosis. Ágar MRS-Lactobacillus casei

29. Azotobacter spp. • Bacilos o cocos Gram negativos • Habitan en el suelo y en el agua • Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3) • Vida libre • Forman quistes (similar a endosporas) Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable). Crecimiento a 28ºC.