DNR mikrogardelės: principas galimybės taikymas

1. 3.5 Genų ekspresijos analizė • DNR mikrogardelės: • principas • galimybės • taikymas

2. 1. Struktūrinė genomika: Genomo sekvenavimas ir išreikštų sekų žymenys (EST) 2. Funkcinė genomika: • Genų pasireiškimo nustatymo būdai: Mikro-gardelės ir DNR sekų nuskaitymo profiliavimas • Įterpimo mutagenezė • Atskiro nukleotido polimorfizmo (SNP) žymėjimas genolapyje • Genolapiu paremtas sugretinimas (angl. map-based cloning) http://www.genetik.uni-bielefeld.de/MolMyk/treffen/work2/bioinformatikworkshop/

3. BIOtechnologijos(genomika) NANOtechnologijos(mikrogardelių lustai) INFORMACINĖS technologijos Tyrimai mikrogardelių pagalba

4. DNR RNR Baltymai transkripcija (RNR sintezė) transliacija (baltymo sintezė) replikacija Centrinė molekulinės biologijos dogma

6. Tradicinė biologija: Ieško genų, kurie skirtingai pasireiškia Tiria šių genų funkcijas Nustato tiriamo geno sąveiką su kitais genais Tyrimai paremti mikrogardelių principu: Galima masinė paralelinė genų ekspresijos analizė Nedidelį genomą galima tirti visą iškart Nustato ne tik atskirus besiskiriančius genus, bet ir besiskiriančias genų grupes Analizė parodo santykinio ekspresijos lygio skirtumus Analizuoti galima ne tik atskirą molekulę, bet ir jų kompleksus Efektyvi funkcinė genų analizė Galima identifikuoti reguliacinius ir ląstelių procesus

7. DNR mikrogardelės, taip pat vadinama genų lustais (angl. DNA chips, DNA arrays, DNA microarrays), yra funkcinės genomikos metodas, skirtas diagnostikai, mutacijų ir polimorfizmo suradimui, genų paieškai, genų ekspresijai tirti bei genolapių kūrimui. (detalesnė informacija Gibson 2002) Jau daugiau nei dešimtmetį (nuo 1995 m.) gyvuoja DNR mikrogardelių technologija, kurią naudojant galima vienu metu tirti visų organizmo koduojamų genų ekspresiją. Tai vienas iš efektyviausių genomo tyrimo metodų ir jo atsiradimas buvo sąlygotas didėjančio sekvenuotų genomų skaičiaus bei poreikio tirti įvairių organizmų genų funkcionavimą. DNR gardelių metodas panaudotas žmogaus genų ekspresijos sveikuose audiniuose įvertinimui. Gauti transkripcijos lygio standartai naudojami patologinių procesų nustatymui.

8. DNR mikrogardelių principas GACTGAACGT |||||||||| T C CTGACTTGCA T A G C G T C A T T G T TAGGC ATCCGACAATGACGCC Nežinoma Žinoma • Vertinimasnežinomos DNR (susintetinta atvirkštinės transkriptazės pagalba nuo iš ląstelės išskirtų mRNR) panaudojant hibridizaciją. • Žinoma DNR yra taškuojama ant plokštelės. • Pažymėta nežinoma DNRsuliejama su žinoma DNR ir vyksta hibridizacija. • Plokštelė yra nuplaunama ir skenuojama. http://www.biology.washington.edu/fingerprint/

9. Suformuotos mikrogardelės talpina tūkstančius skirtingų DNR pavyzdžių. Gardelės gali būti formuojamos ir tiesiai ant aktyvuoto stiklo paviršiaus sintetinant oligonukleotidus. Tai dažniau naudojamas būdas. Oligonukleotidai (tai paprastai tai 20-30 nukleotidų vienguba grandinė) naudojami komplementarios DNR segmentų suradimui. Genų ekspresijos lygis (t.y. žymėtos mRNR kiekis prisijungęs prie mikrogardelėse esančios DNR) įvertinamas kompiuterinių programų pagalba, lyginant fluorescencijos signalų raiškumą. Tai kiekybinė analizė. www.bioalgorithms.info

10. DNR mikrogardelės (taškinės gardelės) 1) Gardelės suformuojamos iš reikiamų cDNR fragmentų 2) Panaudojamas didelio tikslumo automatinis taškavimas 3) cDNR taškuojama ant mikroskopo stiklo plokštelių

13. DNR gardelių technologijos Gardelės Taškų tankis Zondas Mėginys Žymėjimas tipas (1 cm2) Nailono makrogardelės <100 cDNR RNR Radioaktyvus Nailono Radioaktyvus/ mikrogardelės <5000 cDNR mRNR Fluorescencinis Stiklo mikrogardelės <10000 cDNR mRNR Fluorescencinis Oligonukleotidų Gardelės <250000 oligonukleotidai mRNR Fluorescencinis www.eng.uiowa.edu/~tscheetz/doc/CLCG/PPT

14. Kiekvienoje mikrogardelėje (dydis maždaug 100um) yra PCR sekvenuotos DNR sekos http://www.bioinfbook.org

15. ACTGC ACTGC ATCCGACAATGACGCC Visiškas atitikimas ACTGC ATCCGACAATGACGCC ATTCC Mažesnis atitikimas ATCCGACAATGACGCC ACCCC Mažasatitikimas ATCCGACAATGACGCC Hibridizacijos principas yra panaudojamas genų ir jų ekspresijos nustatymui, o taip pat DNR sekų atitikimo palyginimui. Fluorescenciškai pažymėti mėginiai hibridizacijos proceso metu jungiasi prie mikrogardelių DNR www.bioalgorithms.info

17. http://www.fao.org/DOCREP/003/X6884E/

18. Taškinės mikrogardelės metodu (angl. spotted or two-channel microarrays) negalima nustatyti absoliučios geno veiklos išraiškos Genas 1 Genas N

19. Oligonukleotidų mikrogardelės (angl. oligonucleotide or single-channel microarrays) metodu (iš dešinės) galima nustatyti absoliučią geno veiklos išraišką

21. Duomenų analizė eksperimentas 1 eksperimentas 2 eksperimentas 3 Genasi: (x1,x2,x3,…) Tai šio geno ekspresijos profilis x1,x2,x3,.. paprastai yra logaritminėje skalėje 1) Atskirų genų analizėAbsoliučios reikšmės gali būti klaidinančios.Reikalingas atskaitos taškas (kontrolė) tam, kad būtų galima statistiškai įvertinti atskiro geno ekspresijos patikimumą. Naudojamas vidurkis/nukrypimas patikimumo įvertinime. 2) Ko-ekspresijos analizėPanašiai išreikštų (ekspresuotų) genų paieška

22. Genų p ekspresijos duomenysmėginiuosen iRNRmėginiai mėginys1 mėginys2mėginys3mėginys4 mėginys5 … 1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ... 2 -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ... 3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ... 4 -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ... 5 -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ... Genai Geno i ekspresijos lygis iRNRmėginyjej Log( Raudonos sp.intensyvumas/Žalios sp. intensyvumas) = Log(Vidurkis PM - Vidurkis MM)

23. Mikrogardelių panaudojimas Genų ekspresijos analizė: Ieško genų skirtumų Tiria atsaką į aplinkos faktorių įtaką Ligų eigą ir vykstančius procesus Vaistų poveikį DNR sekų variacijos nustatymas: Genetinis charakterizavimas Somatinių mutacijų aptikimas Tiesioginis sekvenavimas

24. DNR mikrogardelės gali būti naudojamos konkrečiose chromosomų vietose esančių genomo sekų nuskaitymui ir vertinimui. Atskiro nukleotido polimorfizmo (SNP) mikrogardelės naudojamos individų ar tarppopuliacinės genetinės variacijos nustatymui. Trumpų oligonukleotidų gardelės gali būti naudojamos atskiro nukleotido polimorfizmo identifikavimui, tam kad patikrinti jo įtaką genetinei įvairovei ar genetiškai užkoduotą polinkį įvairioms ligoms. • Palyginti neseniai pradėtas naudoti DArT (angl. Diversity Array Technology) metodas genetinio polimorfizmo nustatymui (žr. Jaccoud et al. 2001). Gali būti taikomas grupės ar pavienių individų tyrimams, atitinkamai formuojant tiriamuosius mėginius. • DArT taikymo procesas susideda iš 4 pagrindinių dalių: • polimorfinės gardelės (angl. diversity panel) formavimas iš genetiškai įvairios grupės individų genominės DNR • tiriamųjų mėginių formavimas ir jų fluorescencinis ženklinimas (Cy3 ir Cy5) • hibridizacija tiriamųjų mėginių su polimorfine gardele • plokštelių skenavimas ir analizavimas

25. Preliminarus žymenų sistemų lyginimas analizuojant manijoko genetinės įvairovės struktūrą SSR: 36 SSR žymenys DArT: gardelė iš ~1000 klonų •Kodominantiniai žymenys •Dominantiniai žymenys •Labai polimorfiniai • Vidutiniškai polimorfiniai •Paruošimo kaina • Paruošimo kaina ~36000 US$ (36 žymenims) ~20000 US$ gardelei (1000 polimorfinių genų klonų) •Žemas našumas •Didelis našumas •Genetinės informacijos kaina • Genetinės informacijos kaina /lokusas /genotipas: 0.5 US$ /lokusas /genotipas: 0.025 US$ DArT metodas yra nepriklausomas ar nesiremia informacija apie DNR sekas. Gali būti taikomas genų bankų kolekcijoms vertinti, nes padengia didelę genomo dalį (mikrogardelių metodo naudojimas SNP tarp genotipų vertinimui, yra kol kas per brangus platesniam taikymui). http://www.generationcp.org/vw/Download/ARM_2004/

26. Eksperimento dizainas Tiriamos medžia-gos parinkimas EST duomenų bazės Duomenų bazė 1 Duomenų bazė n Pelė Žiurkė Ekspresijos skirtumų analizė Statistinė analizė Klonų per-grupavimas Koordinuota genų ekspresija Plokštelės paruošimas Mėginių pa-ruošimas Mikrogardelės dizainas Žmogus Pušis Mikrogardelių duomenų bazė Hibridizacija Kompiuterinė analizė Kitosduomenų bazės Gauto vaizdo pavertimas kiekybiniais duomenimis

27. Duomenų gavimas eksperimentuose naudojant mikrogardelių metodus

28. MIAME duomenų bazė (minimumas informacijos apie mikrogardelių eksperimentą)

29. Eichinger 2005

30. Duomenų normalizavimas (išsibarstymo sumažinimas ir variacijos suvienodinimas tarp pakartojimų) Klasteriavimas T-testai

31. •Kiekvienam genui apskaičiuojama vidutinė išraiška (kontrolinio ir bandomo varianto) • Nulinė hipotezė: abu variantai nesiskiria • Slenkstinė t-testo reikšmė paprastai imama p<0.05 •Tinkamą p reikšmę reikia koreguoti, priklausomai nuo tiriamų genų skaičiaus (kuo didesnis genų skaičius, tuo mažesnė p reikšmė parodo esminius skirtumus)

32. Sample 1 Sample 2 Gene 1 1.04 2.08 Gene 2 3.2 10.5 Gene 3 3.34 1.05 Gene 4 1.85 0.09 Kiekybinė analizė Principinių komponenčių analizė Klasterių sudarymas (hierarchinis, k-vidurkių) Automatinis grupavimas (angl. self-organising maps) Prižiūrima, neprižiūrima analizė (angl. supervised, unsupervised)

33. Clarke and Zhu (2006)

34. SAS programa tipinei DNR mikrogardelių analizei: proc mixed data=duomenys; class dye array; model signal = dye /outp=rrr; random array array*dye; lsmeans dye/pdiff; run;

35. Mikrogardelių eksperimentų privalumai Našumas >20 000 genų per 1-4 savaites Apimtis Mielių ar pelės genomas telpa į vieną gardelę Pritaikomumas Kuo daugiau genomų sekvenuota, tuo daugiau gardelių gali būti pagaminta. Atskiram atvejui galima kurti unikalias gardeles. Praktiškumas Neribojamas RNR pavyzdžių technologinei įrangai pateikimas Ekonomiškumas Gardelės suformavimas 20 000 genų kainuoja apie 350$ Mikrogardelių eksperimentų trūkumai Kaina Kai kuriais atvejais mokslininkams yra per brangu naudoti reikiamus kontrolinius variantus ar pakartojimus. RNR Genų ekspresijos galutinis produktas yra baltymas. reikšmingumas Kokybės kontrolė Neįmanoma atskirus elementus įvertinti ant gardelės paviršiaus. Įvairūs iškraipymai skenuojant gardelę ar analizuojant duomenis (angl. artifacts).

36. Genomika/proteomika yra labiausiai besivystančios sritys miško biotechnologijoje. Tikėtina, kad visas genomas ar didžioji dalis išreikštų genų sekų bus artimiausiu metu gauta, be Populus trichocarpa, dar bent 2 miško medžių rūšims – tai Pinus taeda ir Eucalyptus globulus. Tada dar labiau suintensyvės funkcinės genomikos vaidmuo (mikrogardelių taikymas, modelinių medžių rūšių lyginimas su tiriamomis, genetinių modifikacijų tyrimai). Didelės EST bibliotekos bus naudojamos kandidatinių genų tyrimuose, ypač padaugėjus modelinių medžių rūšių su pilnais fiziniais ir genetiniais genolapiais. Lyginamoji genomika ir jos taikymas gali pasiekti ne tik rūšies, genties, bet net ir šeimos lygį. Kartu su fundamentaliaisiais tyrimais išaugs ir taikomųjų tyrimų apimtys. Kartu su tradicine medžių selekcija bus taikomi siejamosios (angl. association) genetikos metodai, identifikuojant norimus genų alelius. Vis daugiau genų bus identifikuojama genetinių modifikacijų tyrimuose. Ateityje oligonukleotidų pagrindu sudaromos mikrogardelės, kaip duodančios patikimesnius rezultatus, matomai keis klonų pagrindu sudaromas, nežiūrint to, kad pastarosios yra mažiau kainuojančios. Taip pat galima laukti didesnio mikrogardelių panaudojimo miško medžių selekcijoje. www.fao.org/biotech/

37. Literatūros sąrašas Baldi P. and Hatfield G.W. 2002. DNA Microarraysand Gene Expression,Cambridge. Bretz F., Landgrebe J. and Brunner E. 2003. Efficient design and analysis of two color factorial microarray experiments. Biostatistics. Clarke J.D. and Zhu T. 2006. Microarray analysis of the transcriptome as a stepping stonetowards understanding biological systems: practicalconsiderations andperspectives. The Plant Journal 45: 630–650. Mount D.W. 2004. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. 2nd Edition, ColdSpring Harbor, p. 692. Gibson G. 2002. Microarrays in ecology and evolution: a preview. Molecular Ecology 11:17–24. Jaccoud D., Peng K., Feinstein D. and Kilian A. 2001. Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research 29.

38. FAO. 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. ForestGenetic Resources Working Paper FGR/59E. Forest Resources Development Service, ForestResources Division. Rome, Italy. Kohane I.S. et al. 2002. Microarrays for an Integrative Genomics. MIT Press, Cambridge, MA. McLachlan G.J., Do K-A., Ambroise C. 2004. Analyzing Microarray Gene Expression Data. Hoboken, NJ: Wiley. Spooner D., van Treuren R. and de Vicente M.C. 2005. Molecular markers for genebank management. IPGRI Technical Bulletin No. 10. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. Speed T. 2003. StatisticalAnalysis of Gene ExpressionMicroarray Data. Chapman& Hall/CRC, p. 240.