Bioinformatica Banche dati biologiche 25-03-2011

1. BioinformaticaBanche dati biologiche25-03-2011 Prof. Alfredo Ferro

2. Banche dati biologiche • Organismi e sequenze biologiche • Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati • Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ • NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein • BLAST • Pubmed Bioinformatica: Banche dati biologiche

3. Gli organismi viventi: classificazione • Nelle scienze biologiche la classificazione è un concetto che si riferisce alle modalità con le quali i biologi raggruppano e categorizzano gli organismi viventi. • La filogenesi è il processo evolutivo degli organismi viventi dalla loro comparsa sulla terra a oggi • La classificazione filogenetica è un sistema artificiale che consente di identificare i gruppi tassonomici degli organismi viventi sulla base dei loro rapporti evolutivi Bioinformatica: Banche dati biologiche

4. Gli organismi viventi: classificazione • La moderna classificazione scientifica è il frutto della categorizzazione operata da Linneo e riletta secondo le teorie di Darwin • Col sistema linneano ogni organismo viene posizionato, mediante una scala gerarchica, in una serie di gruppi tassonomici, detti taxa (taxon al singolare). Le suddivisioni principali, dal più generico al più specifico, sono: Dominio, Regno, Phylum, Classe, Ordine, Famiglia, Genere e Specie. Bioinformatica: Banche dati biologiche

5. Classificazione: esempi Bioinformatica: Banche dati biologiche

6. Organismi: nomenclatura • La nomenclatura binomiale è una convenzione standard utilizzata in biologia per conferire il nome ad una specie. • Il nome scientifico di una specie viene coniato dalla combinazione di due nomi: • il nome del genere a cui appartiene la specie • un epiteto che caratterizza e distingue quella specie dalle altre appartenenti a quel genere. • Il primo termine (nome generico) porta sempre l' iniziale maiuscola, mentre il secondo termine (nome specifico) viene scritto in minuscolo; entrambi i nomi vanno inoltre scritti in corsivo Bioinformatica: Banche dati biologiche

7. Nomenclatura: esempi Bioinformatica: Banche dati biologiche

8. I Geni • Il gene è l’unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi; ad esso sono associate molteplici informazioni: AnalisiFilogenetica Struttura Proteina(Funzione) Sequenze omologhein altri genomi Gene Sequenza Localizzazionegenomica Bioinformatica: Banche dati biologiche

9. Le sequenze biologiche • Le sequenze nucleotidiche vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 4 caratteri (A, C, G, T), nelle quali ciascun carattere rappresenta un singolo nucleotide. • Analogamente le sequenze proteiche (o aminoacidiche) vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 20 caratteri, ciascuno dei quali rappresenta un singolo aminoacido. Bioinformatica: Banche dati biologiche

10. L’alfabeto di DNA e RNA

11. L’alfabeto delle proteine

12. Lo Standard IUB/IUPAC Bioinformatica: Banche dati biologiche

13. Outline • Organismi e sequenze biologiche • Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati • Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ • NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein • BLAST • Pubmed Bioinformatica: Banche dati biologiche

14. Motivazioni • Lo sviluppo delle biotecnologie molecolari ha portato alla produzione di enormi quantità di dati biologici. • Le banchedati sono progettate come contenitori costruiti per immagazzinare dati in modo efficiente e razionale al fine di renderli facilmente accessibili a tutti gli utenti: ricercatori, medici, biologi, studenti, etc. . . • Il fine ultimo è quello di recuperare ed analizzare questi dati mediante gli appositi tool di cui ciascun database dispone. Bioinformatica: Banche dati biologiche

15. I Database Biologici • Numerose sono oggi le banche dati biologiche esistenti: • Banche dati primarie (sequenze nucleotidiche e aminoacidiche) • Banche dati specializzate (domini e motivi proteici, strutture proteiche, geni, trascrittoma, profili di espressione, pathways metaboliche, etc) Bioinformatica: Banche dati biologiche

16. Organizzazione delle banche dati • Le banche dati biologiche raccolgono informazioni e dati derivati da: • Letteratura; • Analisi di laboratorio (in vitro e in vivo); • Analisi bioinformatiche (in silico). • Ogni banca dati è caratterizzata da un elemento biologico centrale che costituisce l’oggetto intorno al quale viene costruita la entry principale della banca dati. Bioinformatica: Banche dati biologiche

17. Organizzazione delle banche dati (2) • Ciascuna entry raccoglie quindi le informazioni che caratterizzano l’elemento centrale (attributi). • Molte banche dati biologiche sono fruibili da parte della comunità scientifica in formato flat-file, cioè file sequenziali nei quali ogni classe di informazione è riportata su una o più linee consecutive identificate da un particolare codice. • Tali file sono dunque semplici file di testo strutturati in modo tale da essere analizzabili mediante opportuni tool in grado di estrarre le informazioni di interesse. Bioinformatica: Banche dati biologiche

18. Database e tool bionformatici • La maggior parte delle banche dati mettono a disposizione dei tool bioinformatici per l’elaborazione di questi dati, tra i quali: • Tool per lo screening di banche dati (BLAST, FASTA); • Tool per l’allineamento multiplo di sequenze (ClustalW, AntiClustAl, T-Coffee, ProbCons …); • Tool per l’identificazione di esoni ed elementi regolativi che caratterizzano un gene – Gene and Promoter Prediction (GenScan, Promoser, … ); Bioinformatica: Banche dati biologiche

19. Il problema della nomenclatura • Uno dei principali problemi legati alle banche dati biologiche è quello della nomenclatura. • Uno stesso gene può avere diversi nomi (Es. TRF2 è anche noto come TLP o TLF), o uno stesso nome può individuare diversi geni (Es. TRF sta per TBP Related Factor ma anche per Transferrina o ancora per Telomeric Repeat Binding Factor). • Occorre quindi un modo per individuare univocamente i geni e le proteine, e per gestire la grande quantità di informazioni ad essi legate: nelle banche dati primarie ogni elemento (gene, sequenza, etc) è individuato univocamente da un accession number. Bioinformatica: Banche dati biologiche

20. Outline • Organismi e sequenze biologiche • Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati • Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ • NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein • BLAST • Pubmed Bioinformatica: Banche dati biologiche

21. Banche dati primarie • Le banche dati primarie contengono sequenze nucleotidiche (DNA e RNA) e aminoacidiche (proteine). • Esistono tre banche dati primarie: • GenBank (NCBI – National Center for Biotechnology Information). • EMBL datalibrary (EMBL – European Molecular Biology Laboratory). • DDBJ (DNA Database of Japan) • Questi istituti cooperano tra loro al fine di condividere e rendere pubblicamente disponibili tutti i dati di cui dispongono e differiscono tra loro solamente per il formato con cui tali dati vengono rilasciati. Bioinformatica: Banche dati biologiche

22. Outline • Organismi e sequenze biologiche • Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati • Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ • NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein • BLAST • Pubmed Bioinformatica: Banche dati biologiche

23. NCBI • NCBI (National Center for Biotechnology Information) è l’istituto americano che ospita GenBank, una delle tre banche dati primarie di sequenze nucleotidiche (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). • NCBI offre anche svariati strumenti per l’analisi di dati biologici tra cui BLAST, un tool che permette di effettuare ricerche per similarità nei database di sequenze. Bioinformatica: Banche dati biologiche

24. I principali DB di NCBI • Gene • Contiene dati inerenti i geni di tutte le specie caratterizzate, quali la struttura genica ed il contesto genomico, le ontologie, le interazioni con altri geni ed i link alle sequenze ed alla relative pubblicazioni scientifiche. • Nucleotide • Contiene le sequenze nucleotidiche di tutte le specie caratterizzate, siano esse codificanti o meno. • Protein • Ha la stessa struttura di Nucleotide ma è relativo alle sequenze aminoacidiche. • Pubmed • E’ il database delle pubblicazioni scientifiche di carattere biologico e biomedico. Per ogni articolo è disponibile l’abstract. Pubmed Central contiene articoli completi scaricabili gratuitamente. Bioinformatica: Banche dati biologiche

25. Entrez • I vari database di NCBI sono accessibili mediante un unico motore di ricerca che prende il nome di Entrez: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html Bioinformatica: Banche dati biologiche

26. Esempio di ricerca: BAX • Ricerchiamo i dati relativi al gene BAX in Homo sapiens utilizzando Entrez:

27. Esempio: BAX – Database: Gene

28. Esempio: BAX su Gene • Informazioni generali • La prima parte della pagina contiene il simbolo (BAX) ed il nome ufficiale del gene (BCL2-associated X protein). • Vengono specificati il tipo di gene (Protein coding – codificante per proteina), l’organismo (Homo sapiens) e la tassonomia (lineage). • Viene inoltre data una panoramica sulle funzioni principali del gene (summary). Bioinformatica: Banche dati biologiche

29. Esempio: BAX su Gene • Regioni genomiche, trascritti e prodotti • In questa sezione viene mostrato il grafico della struttura del gene. • Ogni riga rappresenta una variante di splicing (le varianti differiscono nel numero e nelle dimensioni degli esoni, indicati da rettangolini, gli introni sono rappresentati dalle linee sottili). • I rettangolini (esoni) possono essere rossi (codificanti) o blu (non codificanti: UTR). • A sinistra di ogni isoforma è presente il link alla sequenza nucleotidica dell’mRNA maturo relativo. • A destra di ogni isoforma è presenta il link alla sequenza della proteina corrispondente. • In alto è presente il link alla sequenza completa del gene (UTR, esoni ed introni). • E’ possibile cliccare sui singoli elementi della figura per ottenere la sequenza relativa. Bioinformatica: Banche dati biologiche

30. Esempio: BAX su Gene 30 • Contesto genomico • Il grafico del contesto genomico mostra la regione genomica che contiene il gene ed i geni limitrofi. • Le frecce indicano il filamento (destra: senso, sinistra: antisenso). • In questo caso BAX si trova sul filamento senso. • Interazioni con HIV ed altre proteine cellulari • In una sezione successiva sono mostrate le interazioni della proteina BAX con HIV. • Segue la lista delle interazioni note di BAX con tutte le proteine cellulari. • Altre informazioni • Di seguito sono riportati i fenotipi patologici correlati a BAX (Colorectal cancer e T-cell acute lymphoblastic leukemia), i link alle pathway in cui BAX è coinvolto (Database KEGG) e le annotazioni ontologiche di BAX (Processi, funzioni e localizzazione cellulare). Bioinformatica (3): Banche dati biologiche 25-03-2011

31. Esempio: Gene Table • Selezionando nella tendina in alto (Display) la voce Gene Table, si ottiene la tabella numerica con le informazioni sulla struttura del gene. 31 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche 25-03-2011

32. Esempio: BAX su Nucleotide • Cliccando sui link a sinistra delle isoforme, nella struttura genica, si può ottenere direttamente la sequenza dell’mRNA (In formato Fasta) o la pagina di Genbank relativa a BAX (Database Nucleotide). • GenBank – Informazioni generali • Tra le informazioni più rilevanti troviamo il LOCUS (NM_138764), ovvero il codice identificativo univoco della sequenza, la lunghezza della sequenza (986 bp – base pairs) ed il tipo di sequenza (mRNA). • Segue la lista delle pubblicazioni relative a BAX. • Vengono dati dettagli sulle regioni della sequenza • La sequenza codificante (CDS) è compresa tra 70 e 564. Ciò significa che le sequenze 5’ UTR e 3’UTR andranno rispettivamente da 1 a 69 e da 565 a 986. • In fondo alla pagina viene riportata la sequenza nucleotidica, alla quale si può accedere anche in formato FASTA cliccando sul link corrispondente nella stessa pagina, in alto. 32 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche 25-03-2011

33. Esempio: BAX su Protein • Cliccando sui link a destra delle isoforme, nella struttura genica, si può ottenere direttamente la sequenza della proteina (In formato Fasta) o la pagina di GenPept relativa a BAX (Database Proteine). • GenPept – Informazioni generali • Tra le informazioni più rilevanti troviamo il LOCUS (NP_620119), ovvero il codice identificativo univoco della sequenza e la lunghezza della sequenza (164 aa – aminoacidi). • Segue la lista delle pubblicazioni relative a BAX. • In fondo alla pagina viene riportata la sequenza aminoacidica, alla quale si può accedere anche in formato FASTA cliccando sul link corrispondente nella stessa pagina, in alto. 33 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche 25-03-2011

34. Outline • Organismi e sequenze biologiche • Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati • Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ • NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein • BLAST • Pubmed Bioinformatica: Banche dati biologiche

35. Ricerca per similarità • Una delle operazioni più comuni ed utili su una base di dati biologica è la ricerca di sequenze simili ad una sequenza data in input. • Il tool più popolare per questo tipo di ricerche è BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). • BLAST esegue confronti fra coppie di sequenze alla ricerca di regioni di similarità, piuttosto che un allineamento globale tra le intere sequenze. • BLAST può eseguire migliaia di confronti fra sequenze in pochi minuti e in poco tempo è possibile confrontare una sequenza query con l’intero database per ricercare tutte le sequenze simili ad essa.

36. Come funziona BLAST? Ecco i passi dell’algoritmo di BLAST: • Si estraggono tutte le possibili word di m lettere dalla sequenza query (m=3 per le proteine, m=11 per il DNA). • Per ogni word della sequenza da esaminare viene costruita una lista di possibili words che, se confrontate con la sequenza in questione, hanno un punteggio superiore ad un valore-sogliaT (compreso fra 11 e 15) calcolato di volta in volta in base alla composizione e alla lunghezza della sequenza in esame.

37. Come funziona BLAST? (2) • Si confronta la lista di words con le sequenze contenute nel database alla ricerca di matches esatti: • Quando viene riscontrata una corrispondenza (hit), essa viene estesa a monte e a valle per vedere se è possibile definire un tratto di sequenza in grado di raggiungere un punteggio superiore ad un valore-sogliaS.

38. Come funziona BLAST? (3)

39. NCBI BLAST • L’implementazione più popolare dell’algoritmo BLAST si trova sul sito dell’NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST • Sono disponibili numerosi tipi di BLAST; quelli su cui concentreremo la nostra attenzione sono: • BLASTN (Nucleotidi – Nucleotidi); • BLASTP (Proteine - Proteine); • TBLASTN (Translated BLAST Nucleotide); • BL2SEQ (Blast 2 sequences).

40. BLASTN: Esempio con BCL2 Selezioniamo nucleotide blast Inseriamo la sequenza (o scegliamo un file da uploadare) Scegliamo database e organismo Scegliamo il programma giusto (blastn)

41. BLASTN: Esempio BCL2 (2) E’ possibile utilizzare un filtro per mascherare segmenti a bassa complessità composizionale, ovvero il cui matching avrebbe scarso significato biologico. E’ possibile cambiare la soglia di significanza statistica. Ogni match trovato ha un valore di significanza statistica, che indica quanto è statisticamente probabile che quel match sia casuale. E’ possibile variare la soglia così che matches con significanza maggiore della soglia impostata non vengano visualizzati. Abbassando la soglia avremo in output un minor numero di matches ma più significativi, avendo eliminato tutti quei matches che hanno un’alta probabilità di essere casuali.

42. BLASTN: Esempio BCL2 (3) E’ anche possibile cambiare la dimensione delle words della query che BLAST va a ricercare nel database. Il valore di default per le sequenze nucleotidiche è 11, per quelle proteiche 3.

43. BLASTN: Esempio BCL2 (4) Una volta settati i parametri, cliccando prima su BLAST e successivamente su FORMAT si ottiene il risultato della ricerca:

44. BLASTN: Esempio BCL2 (5) BLAST fornisce in output la distribuzione dei matches trovati, assegnando a colori diversi i diversi scores: ovviamente uno score maggiore indica un match più significativo. Cliccando sulle barre colorate si ottiene l’allineamento corrispondente.

45. BLASTN: Esempio BCL2 (6) L’allineamento migliore mostra un match del 100%: abbiamo ritrovato lo stesso BCL2 nel database. Abbiamo il link alla sequenza trovata ed alla pagina corrispondente in Gene. Un trattino indica il match dei caratteri delle due sequenze.

46. BLASTN: Esempio BCL2 (7) • L’assenza del trattino invece indica un mismatch:

47. BLASTP, TBLASTN e BL2SEQ • BLASTP è la versione di BLAST per le proteine. Funziona esattamente come la versione per le sequenze nucleotidiche. • TBLASTN confronta la proteina query con il database di sequenze nucleotidiche; per effettuare questo tipo di confronto le sequenze nucleotidiche nel database vengono dinamicamente tradotte in sequenze aminoacidiche secondo tutte le ORF (6) e queste vengono confrontate con la proteina query. • I parametri sono essenzialmente gli stessi visti per BLASTN. • BLAST2SEQ effettua l’allineamento tra due sequenze utilizzando l’algoritmo di BLAST.

48. Blast2Seq • Blast2Seq è un tool della famiglia BLAST che permette di eseguire l’allineamento di una coppia di sequenze utilizzando l’algoritmo di allineamento locale di BLAST. • E’ importante sottolineare la differenza tra questo tipo di approccio e quello globale: • L’allineamento Pairwise Globale di coppie di sequenze mette in luce l’eventuale similarità globale tra le due sequenze. • L’allineamento Pairwise effettuato da Blast2Seq mette in luce le eventuali similarità locali tra le due sequenze. Due sequenze possono anche essere molto diverse nella loro interezza ma avere comunque delle regioni molto simili: a partire da tale similarità è spesso possibile formulare interessanti ipotesi sulla presenza di determinati motivi e quindi sulla funzione delle molecole analizzate.

49. Blast2Seq: un esempio • Diamo in input la sequenza della proteina TBP dell’uomo e quella di TBP della Drosophila:

50. Blast2Seq: un esempio (2) • Nella figura restituita in output da Blast2Seq vengono messi in evidenza i segmenti allineati: in questo caso sono state allineate le parti C-terminali delle due sequenze, con identità pari all’89% (Il famoso “dominio a sella” mediante il quale TBP interagisce con il DNA e che risulta altamente conservato rispetto al resto della sequenza).