Avaliação da diversidade microbiana

1. Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e técnicas

2. Dificuldades na avaliação: • Falta de recursos humanos capacitados • Falta de financiamento • Amplitude da diversidade • Erosão da diversidade • Falta de metodologias Porquê avaliar? Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

3. Etapas da avaliação • Amostragem • Processamento • Detecção e avaliação – técnicas: • i.   Fenotípicas • ii.   Moleculares • iii. Imunológicas

4. Coleta das amostras • Etapa crítica • São usados equipamentos especializados • Devem ser considerados os seguintes fatores: • Representatividade • Não alterar os números e as atividades • Evitar a introdução de contaminantes • Estocar em condições adequadas

5. Problema da representatividade • Uso de amostras compostas para minimização do erro • Determinação do numero de amostras mínimo • Estatística determinará os limites de confiança

6. Estratégias de amostragem Ar é um meio restritivo para os microrganismos (1) Acesso - direto Amostragem no Número de microrganismos - Baixo Ar Equipamentos (1) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos Processamento - Concentração em filtros

7. Microbiota do Ar Morte dos microrganismos no ar Xt = X0-k.t K- coeficiente de inativação Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O2 Íons, dentre outros

8. Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

9. Amostragem do ar 1.Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; fluxo de ar e velocidade) 2. Colisão - Captura em liquido. Ex: AG-30 3. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Anderson 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

10. Coletor de Anderson AG-30

11. Equipamentos para amostragem do ar: Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

12. Método usado nas estações espaciaisDados NASA

13. Importância Aeromicrobiologia extramuro: Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramuro: Edificios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

14. Depende nível de matéria orgânica Acesso - Direto ou remoto Amostragem na Números - elevados ou baixos água Equipamentos -Recipientes, filtros Processamento - diluição ou concentração

15. ROV(Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais Yellowstone Park Águas termais(difíceis de amostrar convencionalmente) Equipamentos Mensageiro controlado remotamente abre o recipiente para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades

16. Amostragem em Acesso - Remoto Número de microrganismos - elevado Sedimentos Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição

17. Profundezas oceânicas mostrando as conexões entre a crosta e os sedimentos. Ocorrem trocas entre os sedimentos e a crosta. Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.

18. Microbiota dos sedimentos Observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Cowen, 2004

19. Ventarolas marinhas Baixa abundância (biomassa) porém microrganismos sempre presentes Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisk et al., 1998

20. Sedimentos: • Elevada diversidade de Bacteria e Archaea • 180 reações metabólicas envolvendo N,S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos • Diversos micro-nichos existentes

21. Acesso - direto Amostragem no Números de microrganismos - elevado ou baixo Solo Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição

22. SOLO Uma simples pá de solo de jardim contém mais espécies de organismos do que pode ser encontrado em toda a floresta Amazônica.

23. Problemas Heterogeneidade espacial solo Distribuição dos microrganismos em agrupamentos Elevada variabilidade entre amostras Tradicionalmente 1-5 g solo Estatística Bactérias existem em “hot-spots”

24. Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA - 1010 /g Características: 1. Microcolônias (interação ativa dentro das populações) 2. Estímulo ao crescimento (populações com elevadas velocidades crescimento) 3. Modificações ambientais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA - 107/g SOLO Distribuição não homogênea

25. Alguns números sobre a estrutura do solo

26. Microrganismos no solo Em cada grama solo tipicamente franco • 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos • > 1X 1010 células viáveis • > 4 X103 espécies • << 0,1% são cultivadas in vitro • Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA • Apenas 1 ou 2 membros cultivados pertencem a ordens conhecidas • Maioria diversidade é desconhecida!

27. Números no solo Números de microrganismos no solo: Bactérias: 106 a 109 g-1 solo Gram - bacilos 17-29% Gram + bacilos 2-7% Actinomicetos: 11-32% Arthrobacter, etc., 31-46% Algas: 101 x 106 g-1Fungos: 104 a 106 g-1Protozoários : 104 a 105 g-1Bacteriófagos: ? % Culturabilidade por grupo: 0.8 a 7 %

28. Solo • Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza especifica e outros índices. • Mas no solo as estimativas da diversidade da microbiota : • Envolvem dificuldades: heterogeneidade, grupos dificeis de cultivar em meio de cultura • Estratégias • Fame • CHO utilização • Técnicas moleculares usando PCR • Sorologia

29. Amostragem no Populações - 107 /g Importantes patogênicos para homem subsolo

30. Importância Cerca de 40 % água consumida pelo homem provem do fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões: Forçado - quando água é movimentada em elevadas quantidades produzindo a movimentação dos microrganismos Passivo - natural sem influência artificial Doenças causadas aumentou 40 % nos últimos 10 anos Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da sub-superficie é muito complexa. Inúmeros trabalhos mostram a dificuldade de remediação de contaminantes nas águas subterrâneas. Processo dispendioso. 1 litro de petróleo pode contaminar 2.000 m3 de água

31. Movimentação da microbiota na sub-superfície

32. Microbiota da subsolo Pesquisada na última década (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: 103-107/g Análise comunidades: Archaea e Bacteria (muitas BRS) Metanogênicas (CO2) CH4 Acetogênicas (HCO3-) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO4-2) sulfídrico H2 é gerado pelo FeO+H2O H2+FeO2 Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

33. Sedimentos profundos 1. Número de bactérias cultiváveis em sedimentos foi cerca de 3 ou 5 ordens de magnitude (1000 a 100.000 x) MENOR do que em solos superficiais.   2. Camadas areia-água apresentaram contagens e atividade mais elevadas, do que as camadas argilosas perto da superfície.  3. Profundidade não é necessariamente limitante ao crescimento e atividade. 4. Estudo enumerou coliformes, redutores de sulfato e metanogênicas: - Atividade anaeróbia medida pelo desaparecimento de lactato, formato e acetato e produção de metano e H2S. Sedimentos não incluem apenas anaeróbios, sendo inclusive de 100 a 100.000 vezes menos do que os aeróbios.   - Número de coliformes baixou drasticamente com a profundidade, mas estão presentes nos fluidos dos poços.

34. Microbiota da subsolo Como sobrevivem? A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”. 2. Infiltraram as águas subterrâneas a partir de águas de superfície (maioria das bactérias que ocorrem em rochas como basalto e granito) 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa (SLiME - Subsurface Lithautotrophic Microbial Ecosystems).

35. Subsolo Recentemente descobertos A. 1-10 microrganismos /g de rocha (10-9 /g de solo superficial rizosférico) B. Densidade das comunidades é desconhecida: - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

36. Não destrutivas Plantas - seiva, filosfera Amostras Animais - sangue, dentes Biológicas Interação microrganismos - macrorganismos

37. ProcessamentoObjetivo: recuperação ótima Problemas: Porosidade dos filtros Composição quimica Concentração - centrifugação e passagem por filtros Microrganismos encontram-se em números inapropriados (elevados ou baixos) e em comunidades (diversas espécies) Enriquecimento Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Diluição - Diluições seriadas

38. Enriquecimento Para microrganismos que metabolizam uma determinada substância ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Desenvolvidas por Beijerinck Cultura de enriquecimento consiste na promoção de condições favoráveis especí.ficas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Exemplo 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio. Exemplo 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de C é o naftaleno. Exemplo 3: coluna de Winogradsky, enriquecimento para quimilitotróficos. Exemplo 4: Para isolar Bacillus formadores de esporos aquecer a cultura mista e plaquea. Seleção natural aplicada in vitro

39. Detecção dos microrganismos Métodos: Fenotípicos - baseadas no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Moleculares - baseadas na constituição genotípica Imunológicos - baseadas nas características imunológicas

40. FenotípicosMétodos baratos e não requeremtreinamento diferenciado Amplificação de sinal: CULTIVO EM MEIO DE CULTURA Técnicas morosas Em alguns sistemas não são precisas Isolamento cultura pura identificação

41. Plaqueamento Diluição seriada Amplificação sinal fenotípico colônias

42. Cultivo Ex: Geobacter metallireducens: CH3COO- + 8Fe3+ + 4H2O 2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+ Adicionar acetato como única fonte de C no meio de cultura permite a detecção de microrganismos que podem metabolizar acetato e usam oxido de ferro como fonte de energia Crescer microrganismos em laboratório com base em características fenotípicas. Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.

43. Corantes vitais e Imunofluorescência

44. Perfil lipídico Técnica não envolve cultivo

45. Perfil de FAME(Fatty acids methyl ester analysis) • Existe grande variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos (membranas). • Perfil FAME = impressão de uma espécie 2. Usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

46. Outras técnicas fenotípicas Requerem vastas livrarias MARA - multiple antibiotic resistance activity ARA - antibiotic resistance analysis CSU - carbon source utilization Detecção de hospedeiros de vírus

47. Avaliação da abundância relativa Enumeração Biomassa Atividade Contagem direta Contagem indireta

48. Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio Fluorecência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Não distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

49. Lâminas para contagem direta

50. Contagem indireta Contagem em placas NMP Técnica de Diluição e plaqueamento