UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO ISTITUTO DI CLINICA MEDICA I LA RACCOLTA CONSAPEVOLE

1. UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO ISTITUTO DI CLINICA MEDICA I LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. “ANTICOAGULANTI E ADDITIVI DI USO LABORATORISTICO LORO INFLUENZA / INTERFERENZA” Dott. Vincenzo Di Garbo M.M.G. – Specialista in Cardiologia Centro delle Dislipidemie e del Rischio Trombotico

2. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. GOOD LABORATORY PRACTICE (“Buona Pratica di Laboratorio”) LA STANDARDIZZAZIONE DEI METODI DI LABORATORIO ( SIA QUELLI RELATIVI AL PRELIEVO DEL CAMPIONE EMATICO SIA QUELLI RELATIVI ALL’ESECUZIONE DEI TESTS ) E’ OGGI CONSIDERATA DI FONDAMENTALE IMPORTANZA E VIENE SOLITAMENTE RIASSUNTA IN UNA DIZIONE PRESA IN PRESTITO DAGLI ANGLOSASSONI: La “GOOD LABORATORY PRACTICE”

3. FISIOPATOLOGIA EMOSTASI E TROMBOSI NELL’AMBITO DELLE ATTIVITA’ DI UN LABORATORIO DI ANALISI UN SETTORE DI PARTICOLARE RILIEVO E’ COSTITUITO DALLO: “STUDIO DELL’EMOSTASI e DELLA TROMBOSI”, I CUI TESTS RICHIEDONO NON SOLO UNA PRECISA COMPETENZA MA ANCHE UNA PROFESSIONALITA’ SPECIFICA.

4. FISIOPATOLOGIA EMOSTASI E TROMBOSI • LA FISIOPATOLOGIA DELL’EMOSTASI E DELLA TROMBOSI RICONOSCE DUE COMPONENTI FONDAMENTALI: • LE PIASTRINE, CHE INTERVENGONO NELL’EMOSTASI PRIMARIA • (FASE RAPIDA CHE EVOLVE IN POCHI SECONDI) • I FATTORI DELLA COAGULAZIONE, CHE INTERVENGONO • NELL’EMOSTASI SECONDARIA (FASE LENTA CHE SI ESAURISCE • IN POCHISSIMI MINUTI).

5. EMOSTASI PRIMARIA E SECONDARIA LE DUE FASI POSSONO ESSERE TENUTE DISTINTE PER I SEGUENTI MOTIVI: • ENTRANO IN AZIONE IN SUCCESSIONE TEMPORALE; • SI REALIZZANO CON MECCANISMI FISIOLOGICI IN PARTE INDIPENDENTI; • POSSONO ESSERE INDAGATE SEPARATAMENTE in laboratorio; • POSSONO GENERARE QUADRI PATOLOGICI per alterazioni delle loro singole componenti (SIA IN SENSO QUANTITATIVO CHE FUNZIONALE); • POSSONO ESSERE INFLUENZATE INDIPENDENTEMENTE DA DIVERSI FARMACI.

7. EMOSTASI PRIMARIA (Fase vasculo-piastrinica) RUOLO DELLE PIASTRINE – TROMBO BIANCO LE PIASTRINE, MENTRE SCORRONO LIBERAMENTE SE IL VASO E’ INTEGRO, TENDONO INVECE AD ADERIRE ALLA BRECCIA VASALE (ADESIVITA’ PIASTRINICA) in particolare al COLLAGENO SOTTOENDOTELIALE. DOPO L’ADESIONE, LE PIASTRINE INIZIANO AD AGGREGARE E, MEDIANTE IL RILASCIO PER UN PROCESSO DI SECREZIONE (RELEASE REACTION) DI COSTITUENTI ENDOPIASTRINICI (ADP,Trombossani, Fattore Piastrinico 3, Serotonina), RICHIAMANO ALTRE PIASTRINE CON ULTERIORE ACCRESCIMENTO DEL COSIDETTO “TROMBO BIANCO”, CHE E’ SUFFICIENTE AD ASSICURARE L’EMOSTASI IN VASI DI PICCOLO CALIBRO A RIDOTTO REGIME PRESSORIO.

8. EMOSTASI PRIMARIA (Fase vasculo-piastrinica) RUOLO DELLE PIASTRINE – TROMBO BIANCO LA FASE PIASTRINICA HA QUINDI UNA IMPORTANZA NOTEVOLE NEL DETERMINISMO DELL’EMOSTASI PRIMARIA, MA NON E’ SUFFICIENTE PER L’EMOSTASI DEFINITIVA. QUESTO SPIEGA LE MANIFESTAZIONI EMORRAGICHE, QUANDO SONO ALTERATI ALTRI SISTEMI EMOSTATICI, QUALI QUELLI DELLA COAGULAZIONE, E LA FASE PIASTRINICA E’ NORMALE.

9. EMOSTASI SECONDARIA (Fase coagulativa) RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI E’ LA FASE PIU’ IMPORTANTE DELL’EMOSTASI, CHE PORTA IN CONDIZIONI NORMALI AD UN ARRESTO PERMANENTE DELL’EMORRAGIA. LE MANIFESTAZIONI EMORRAGICHE CONSEGUENTI AD ALTERAZIONI DI QUESTA FASE SONO INDUBBBIAMENTE PIU’ GRAVI DI QUELLE LEGATE A COMPROMISSIONI DELLA FASE PIASTRINICA.

10. EMOSTASI SECONDARIA (Fase coagulativa) RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI LA COAGULAZIONE SI COMPIE A SEGUITO DELLA FORMAZIONE DI FIBRINA AD OPERA DI UN ENZIMA PROTEOLITICO, LA TROMBINA, CHE TRASFORMA UNA PROTEINA DEL PLASMA, IL FIBRINOGENO (FATTORE I) IN FIBRINA. IL MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE DEL FIBRINOGENO IN FIBRINA E’ ASSAI COMPLESSO, IN QUANTO L’ATTIVAZIONE DELLA PROTROMBINA (FATTORE II) IN TROMBINA E’ PRECEDUTA DA UNA SERIE NUMEROSA DI REAZIONI ENZIMATICHE SUI FATTORI DELLA COAGULAZIONE, CATALIZZATE DALLA PRESENZA DI IONI CALCIO.

12. EMOSTASI SECONDARIA (Fase coagulativa) RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI LE REAZIONI DELLA FASE COAGULATIVA SONO INNESCATE DAL CONTATTO CON SUPERFICI ESTRANEE (AD ES.,IN VIVO, COLLAGENE SOTTOENDOTELIALE o, IN LABORATORIO, SUPERFICI DI VETRO o CAOLINO o AC. ELLAGICO) E PROCEDONO UTILIZZANDO COMPONENTI DI ORIGINE ESCLUSIVAMENTE EMATICA (VIA INTRINSECA DELLA COAGULAZIONE) O DA MATERIALE TROMBOPLASTINICO DI ORIGINE TESSUTALE, DISPONIBILE IN CASO DI LESIONE DI CONTINUO DELLA PARETE VASCOLARE (VIA ESTRINSECA DELLA COAGULAZIONE).

13. EMOSTASI SECONDARIA (Fase coagulativa) RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI NELLA FIGURA DELLA CASCATA COAGULATIVA ERANO RAFFIGURATI ANCHE I DUE PRINCIPALI TESTS CHE STUDIANO LA COAGULAZIONE: IL TEMPO DI PROTROMBINA (PT) , CHE ESPLORA IL SISTEMA ESTRINSECO, E IL TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (aPTT), CHE ESPLORA IL SISTEMA INTRINSECO. L’ESECUZIONE DI QUESTI DUE TESTS CONSENTE DI VERIFICARE NON SOLO LA PRESENZA NEL SISTEMA DI TUTTI I FATTORI DELLA COAGULAZIONE, MA ANCHE SE SONO TUTTI FUNZIONALMENTE EFFICIENTI.

14. TESTS DI LABORATORIO

15. TEST DI AGGREGABILITA’ PIASTRINICA ( sec. Born )

17. GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE RUOLO DEGLI INIBITORI IL SISTEMA COAGULATIVO E’ UN SISTEMA A CASCATA AUTOAMPLIFICANTE (UNA VOLTA CHE UN PROENZIMA SI ATTIVA VA AD AGIRE SUL FATTORE SUCCESSIVO TRASFORMANDOLO IN ENZIMA ATTIVO E COSì VIA) , CHE CULMINA NELL’ESPLOSIVA TRASFORMAZIONE DEL FIBRINOGENO IN FIBRINA. LE REAZIONI ENZIMATICHE DELLA COAGULAZIONE SONO, COMUNQUE, CONTROLLATE E MODULATE DAGLI “INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE”, CHE RIVESTONO UNA FONDAMENTALE IMPORTANZA NELLA IDENTIFICAZIONE DEI PAZIENTI A RISCHIO PER TROMBOSI VENOSE ED ARTERIOSE.

19. GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE ANTITROMBINA III – PROTEINA C / PROTEINA S L’ANTITROMBINA III (AT III) E’ UN INIBITORE FISIOLOGICO DELLA TROMBINA, DEL FATTORE X ATTIVATO (F. Xa) E DI ALTRE PROTEASI SERINICHE DELLA CASCATA COAGULATIVA; E’ DETTA ANCHE CO-FATTORE EPARINICO, PERCHE’ L’EPARINA ACCELERA GRANDEMENTE LA SUA AZIONE DI CONTROLLO DELLA COAGULAZIONE. LA PROTEINA C e LA PROTEINA S SONO PROTEINE VITAMINA K DIPENDENTI CHE INIBISCONO IL F. VIII ED IL F. V. IN PARTICOLARE E’ LA STESSA TROMBINA CHE LEGANDOSI ALLA TROMBOMODULINA ENDOTELIALE ATTIVA LA PROTEINA C, LA CUI AZIONE INIBENTE VIENE ACCELERATA DAL SUO COFATTORE PROTEINA S.

20. GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE ALTERAZIONI CONGENITE e S. TROMBOFILICA NELLE TROMBOSI VENOSE O ARTERIOSE, DI RECENTE SONO STATE IDENTIFICATE MUTAZIONI CHE POSSONO GENERARE UNA CONDIZIONE DI PREDISPOSIZIONE ALLE MALATTIE TROMBOEMBOLICHE quali: IL DEFICIT DI ANTITROMBINA III, DI PROTEINA C, DI PROTEINA S, IL FATTORE V DI LEIDEIN, LA MUTAZIONE DELLA PROTROMBINA E LE DISFIBRINOGENEMIE. TALI CONDIZIONI PRESENTI DA SOLE O IN VARIA COMBINAZIONE HANNO PERMESSO DI IDENTIFICARE “GRUPPI FAMILIARI AD ALTISSIMO RISCHIO TROMBOEMBOLICO” CON NECESSITA’ DI UN TRATTAMENTO ANTICOAGULANTE PREVENTIVO.

21. IL SISTEMA FIBRINOLITICO COMPONENTE ANTI-EMOSTASTICA LA FIBRINOLISI E’ IN REALTA’ UNA COMPONENTE ANTI-EMOSTATICA, IN QUANTO LA SUA ATTIVAZIONE DETERMINA LA DISSOLUZIONE DEL COAGULO DI FIBRINA. TUTTAVIA E’ IMPORTANTE CONSIDERARE LA FIBRINOLISI NEL CONTESTO DELL’EMOSTASI, PERCHE’ UNA SUA ALTERAZIONE PUO’ ESSERE RESPONSABILE SIA DI FENOMENI TROMBOTICI CHE EMORRAGICI.

22. IL SISTEMA FIBRINOLITICO LA PLASMINA IL PRODOTTO FINALE DELLA FIBRINOLISI E’ LA PLASMINA, ENZIMA PROTEOLITICO, CAPACE DI LISARE LA FIBRINA DEL TROMBO (QUESTA REAZIONE GENERA IL COSIDETTO D-DIMERO). TUTTAVIA LA CAPACITA’ LITICA DI QUESTO ENZIMA SI ESTENDE SU ALTRI FATTORI DELLA COAGULAZIONE, FRA CUI ANCHE IL FIBRINOGENO (QUESTA AZIONE GENERA I COSIDDETTI FDP). IN ALCUNI STATI PATOLOGICI (C.I.D., CIRROSI) SI PUO’ EVIDENZIARE UNA IPERPLASMINEMIA, CHE PROVOCA UNA GRAVE DEPLEZIONE DEI FATTORI COAGULATIVI E CHE SI MANIFESTA CON IMPONENTI EMORRAGIE.

23. IL SISTEMA FIBRINOLITICO ATTIVAZIONE DELLA PLASMINA LA PLASMINA E’ GENERATA DAL PLASMINOGENO; QUESTA ATTIVAZIONE PUO’ ESSERE REALIZZATA ATTRAVERSO TRE DIVERSE VIE: - ATTIVAZIONE INTRINSECA (MEDIANTE IL FATTORE XIIa, LA CALLICREINA ED IL CHININOGENO AD ALTO PESO MOLECOLARE- HMWK); - ATTIVAZIONE ESTRINSECA (MEDIANTE L’ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO (t-PA) RILASCIATO DALLA PARETE VASALE DOPO DIVERSI STIMOLI: STRESS-ATTIVITA’ FISICA-STASI); - ATTIVAZIONE FARMACOLOGICA CON UROCHINASI, STREPTOCHINASI O rTPA.

25. IL SISTEMA FIBRINOLITICO ANTIATTIVATORI LE ATTIVAZIONI SIA DELLA VIA INTRINSECA CHE DELLA VIA ESTRINSECA DELLA FIBRINOLISI, SONO A LORO VOLTA REGOLATE DALLA PRESENZA DI ANTIATTIVATORI PLASMATICI (INIBITORE DELL’ATTIVATORE DEL PLASMINOGENO – PAI ) E DALLA PRESENZA DI INIBITORI DELLA PLASMINA CIRCOLANTE (ALFA-2-ANTIPLASMINA, ALFA-2-MACROGLOBULINA, ANTITROMBINA, ALFA1-ANTITRIPSINA, INIBITORE DALLA C1-ESTERASI, ANTICHIMOTRIPSINA).

26. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. LE MODALITÀ OPERATIVE DEL LABORATORIO

27. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. LE MODALITÀ OPERATIVE DEL LABORATORIO LE INDAGINI DI LABORATORIO HANNO COME FINE ULTIMO LA CONFERMA DI UN SOSPETTO DIAGNOSTICO, LA VERIFICA DI UNA DIAGNOSI, L’INDICAZIONE AD UNA TERAPIA o IL CONTROLLO DELL’EFFICACIA DI UNA TERAPIA IN ATTO. PER ASSOVERE A QUESTE ESIGENZE, OGNI PARAMETRO INTERESSATO (DAL CAMPIONE ALLA TRASFORMAZIONE DEI DATI IN UN RISULTATO FINALE) DEVE RISPONDERE A DETERMINATI CRITERI (SICUREZZA DI QUALITA’)

28. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. ERRORI IN LABORATORIO - METODI DI CONTROLLO SI POSSONO RILEVARE TRE GRUPPI DI ERRORI: 1) ERRORI GROSSOLANI DOVUTI PREVALENTEMENTE A SCAMBIO DI REAGENTI, PIPETTE, STRUMENTI E CAMPIONI (VENGONO EVIDENZIATI PER LA GROSSA DISCREPANZA TRA VALORI OTTENUTI E ATTESI); 2) ERRORICASUALI LEGATI ALLA CASUALITA’ CHE COMUNQUE AFFERISCONO A TUTTE LE OPERAZIONI E MISURE; 3) ERRORI SISTEMATICI LEGATI A MODIFICAZIONI PIU’ O MENO GRANDI DI UN LOTTO DI REAGENTI, DI UNO STRUMENTO O DI UNA METODICA (SI RIPETONO IN MODO COSTANTE E SONO RICONOSCIUTI DAL CONTROLLO DEI DATI OTTENUTI PER UN CAMPIONE NOTO CON QUELLI CHE SONO STATI OTTENUTI IN ALTRE CONDIZIONI DI REAGENTI, DI STRUMENTI O DI OPERATORI).

29. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. CONTROLLO DI QUALITA’ (CQ) LA VALUTAZIONE DELL’IMPRECISIONE E’ LA MISURA DELLA CONCORDANZA DEI VALORI MISURATI IN ANALISI RIPETUTE SULLO STESSO CAMPIONE NELLA STESSA SERIE (Coefficiente di Variazione INTRASERIE) o TRA SERIE IN GIORNI DIVERSI (Coefficiente di Variazione TRA SERIE). L’INSERIMENTO DI PLASMI DI CONTROLLO A TITOLO NOTO PUO’ ESSERE UNA VALIDA GUIDA PER L’AFFIDABILITA’ DEI METODI. “UN METODO PRESENTA UNA BUONA AFFIDABILITA’ SE TUTTI I VALORI OTTENUTI RIENTRANO IN 2 DS E COMUNQUE NON SUPERANO UNO SCARTO DEL 5%”.

30. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PAZIENTE : • Digiuno • Dieta • Stress • Esercizio fisico • Ora del prelievo • Trattamenti farmacologici • Postura

31. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PAZIENTE : IL DIGIUNO- LA DIETA Un aspetto di grande importanza NELLA RACCOLTA DEL CAMPIONE DESTINATO ALLE PROVE DI COAGULAZIONE E’ COSTITUITO DAL DIGIUNO (DI ALMENO 12 ORE). Questo stato è imperativo in quanto tutti i fattori della coagulazione e le piastrine risentono della presenza in circolo dei chilomicroni. UN ALTRO DATO DA RACCOGLIERE PRIMA DELL’ESECUZIONE DEL PRELIEVO E’ LA DIETA SEGUITA DAL PAZIENTE. Un esempio di particolare rilievo, è la puntualizzazione del regime dietetico praticato negli ultimi 2-3 giorni nei pazienti sottoposti a terapia con anticoagulanti orali (in particolare l’ingestione di verdure sia esse crude o lessate, soprattutto se a foglie larghe, che per le vitamine in esse contenute possono provocare un falso risultato).

32. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PAZIENTE : LO STRESS-L’ESERCIZIO FISICO-IL FUMO IL PAZIENTE CHE DEVE SOTTOPORSI AD UN PRELIEVO PER COAGULAZIONE NON DEVE ESSERE SOTTO STRESS, NON DEVE AVERE PRATICATO ESERCIZIO FISICO O AVERE FUMATO DA ALMENO 2 ORE, PERCHE’ TUTTE QUESTE CONDIZIONI NON SOLO POSSONO CREARE DIFFICOLTA’ AL REPERIMENTO DELLA VENA, MA ANCHE PROVOCARE UN AUMENTO DELL’EMATOCRITO E UNA ATTIVAZIONE DEI FATTORI COAGULATIVI E DELLE PIASTRINE CHE CONDIZIONERANNO LE PROVE DI LABORATORIO.

33. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PAZIENTE : L’ORA DEL PRELIEVO-LA POSTURA AL FINE DI POTER STANDARDIZZARE LA METODOLOGIA DI RACCOLTA DEL CAMPIONE EMATICO DESTINATO ALLA COAGULAZIONE SI RENDE NECESSARIO CHE L’ORA DEL PRELIEVO VENGA POSTA FRA LE 7.30 E LE 8.30, Sia per tenere conto dei ritmi circadiani che per poter effettuare tutte le determinazioni entro 4 ore. LA POSTURA DEL PAZIENTE CHE SI DEVE SOTTOPORRE AL PRELIEVO VENOSO PUO’ ESSERE DISTESO SU UNA LETTIGA o SEDUTO. La sedia dovrà essere comoda ed accogliente, in un ambiente a temperatura confortevole, mettendo il paziente a suo agio, rispettando la sua privasy, senza rumori sgradevoli o con musica ad alto volume. Tutto ciò renderà il prelievo ben accetto dal paziente, che guarderà l’operatore come una persona amica che non gli arrecherà nocumento.

34. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PRELIEVO VENOSO: • Il prelievo finalizzato • Strumentario per il prelievo • Utilizzazione degli additivi • Stasi venosa • Puntura venosa • Stoccaggio del campione • contenitori • temperatura • tempo • trasporto

35. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. LA STASI VENOSA LA STASI VENOSA, INDOTTA DAL POSIZIONAMENTO DEL LACCIO EMOSTATICO, DEVE ESSERE RIDOTTA AL MINIMO, IN MODO DA EVITARE UNA CONCENTRAZIONE DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE ED UN AUMENTO DELL’EMATOCRITO.

36. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. LO STRUMENTARIO ED IL PRELIEVO LO STRUMENTARIO PER LA RACCOLTA DEL CAMPIONE DESTINATO ALLE ANALISI DI LABORATORIO PER L’ESECUZIONE DI TESTS DELL’EMOSTASI DEVE ESSERE COSTITUITO DA “MATERIALE ANTICONTATTO” (VETRERIA SILICONIZZATA O MATERIALE DI PLASTICA): DALLE SIRINGHE ALLE CUVETTE AI PUNTALI, IN QUANTO L’EFFETTO “CONTATTO” DA’ INIZIO ALLA COAGULAZIONE PER VIA INTRINSECA, PROVOCANDO UNA DEPLEZIONE DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE ED ALTERANDO QUINDI IL RISULTATO FINALE.

37. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PRELIEVO: METODO DELLA DOPPIA SIRINGA PER IL PRELIEVO, IL METODO MIGLIORE PER EVITARE OGNI POSSIBILE INTERFERENZA E’ QUELLO DELLA DOPPIA SIRINGA, CON AGHI GROSSI (TIPO 21G) MONTATI SU SIRINGHE DI PLASTICA DA 10CC. DOPO AVERE ASPIRATO UNA PICCOLA QUANTITA’ DI SANGUE NELLA SIRINGA VUOTA (QUESTA PROCEDURA PERMETTE IL LAVAGGIO DELL’AGO ALLONTANANDO I FRUSTOLI DI TESSUTO PENETRATI NELL’AGO AL MOMENTO DELLA SUA INTRODUZIONE NELLA CUTE E NELLA VENA) SI DISINSERISCE LA SIRINGA VUOTA E SI INNESTA NELL’AGO TENUTO IN POSIZIONE LA SIRINGA CONTENTE 1 ML DI SODIO CITRATO AL 3,8% (o 0,11 M/L) ED, ASPIRANDO LENTAMENTE, SI PORTA LO STANTUFFO SINO ALLA TACCA 10 ML. ESTRATTA LA SIRINGA DALLA VENA SI PROCEDE AD UNA LENTA OSCILLAZIONE DELLA SIRINGA PER UNA PERFETTA MISCELA FRA ANTICOAGULANTE E SANGUE (RAPPORTO 1/10).

38. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. STOCCAGGIO DEL CAMPIONE PER LE DETERMINAZIONI DI LABORATORIO SULL’EMOSTASI, SI RENDE IMPERATIVO CHE LE ANALISI VENGANO EFFETTUATE ENTRO LE 4 ORE DAL PRELIEVO. SE E’ NECESSARIO IL TRASPORTO, LA PROVETTA, BEN TAPPATA, DEVE ESSERE POSTA A TEMPERATURA PROSSIMA AI 7-10 C° (E’ SUFFICIENTE UNA BORSA TERMICA) IN MODO DA RALLENTARE LE ATTIVITA’ ENZIMATICHE CHE SI ATTIVANO A TEMPERATURA AMBIENTE. PER ALCUNE ANALISI SI PUO’ PROCEDERE ALLO STOCCAGGIO DEL CAMPIONE A MENO 70 C°, dopo avere separato il plasma dalla parte corpuscolata.

39. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. ANTICOAGULANTI ED ADDITIVI L’IMPIEGO DEGLI ANTICOAGULANTI E’ STATO A LUNGO DISCUSSO IN LETTERATURA SPECIALISTICA E SI E’ GIUNTI ALLA CONCLUSIONE CHE IL CITRATO SODICO(0,11M/L – OPPURE 3,8%) RAPPRESENTA L’ANTI-COAGULANTE CHE GARANTISCE I RISULTATI PIU’ RIPRODUCIBILI. FRA GLI ADDITIVI, SONO CONSIGLIABILI AL FINE DI INIBIRE LA REATTIVITA’ PIASTRINICA DELLE SOLUZIONI CONTENENTI TEOFILLINA E/O PROSTAGLANDINA E2 (ESISTONO IN COMMERCIO PROVETTE CONTENTI SOLUZIONI GIA’ PREDISPOSTE COME LE “CTAD – TUBES”). PER I TEST FIBRINOLITICI, ALL’ANTICOAGULANTE E’ NECESSARIO AGGIUNGERE UN INIBITORE DEGLI ENZIMI PROTEOLITICI (COME L’AC. EPSILON-AMINO-CAPROICO O L’APROTININA).

40. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. ANTICOAGULANTI: • Sodio Citrato • Eparina-Na • EDTA-Na2 • Eparina-Li • EDTA-K2• CTAD-Tube • Fx Sodium fluoride / Potassio Oxalate • Miscele varie per inibire le piastrine • Stabilizzanti il sistema fibrinolitico

41. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. IL PRELIEVO PER TESTS DELLA COAGULAZIONE: – Punti cruciali • Stasi • Puntura venosa • La “schiuma” • I contenitori • Il rapporto sangue/anticoagulante • Temperatura del lettore • Critico • < 4 ore dal prelievo • assenza di emolisi • siero torbido o opalescente • altri composti interferenti

42. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE NELLA PREPARAZIONE DEL PLASMA PER I TESTS DELLA COAGULAZIONE UN PUNTO CRUCIALE E’ RAPPRESENTATO DALLA CENTRIFUGAZIONE DEL CAMPIONE, CHE DEVE ESSERE ESEGUITA A 3.000 GIRI, PER 10 MIN, IN MODO DA EVITARE LA COMPARSA DI EMOLISI ED ALLONTANARE TUTTA LA PARTE CORPUSCOLATA, SOPRATTUTTO LE PIASTRINE, CHE POSSONO ACCELERARE LE REAZIONI COAGULATIVE. ALLA FINE DELLA CENTRIFUGAZIONE, SE IL PLASMA E’ OPALESCENTE PER LA PRESENZA DI ELEVATI LIVELLI DI CHILOMICRONI E’ NECESSARIO RIPETERE LA CENTRIFUGAZIONE PER ALLONTANARE AL MASSIMO LE PARTICELLE LIPIDICHE.

43. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. PRINCIPALI TEST EMOCOAGULATIVI TRA GLI ESAMI DI LABORATORIO DI PIU’ FREQUENTE RICHIESTA IN CAMPO EMOCOAGULATIVO SONO: - IL TEMPO DI PROTROMBINA (PT), - IL TEMPO DI TROMBOPLASTINA ATTIVATO (aPTT) ed IL DOSAGGIO DEL - FIBRINOGENO (FB). I METODI DI LABORATORIO DI PIU’ LARGA DIFFUSIONE SONO FONDATI SULLA VELOCITA’ DI FORMAZIONE DEL COAGULO (END POINT COAGULATIVO), DA CUI SI RISALE ALLA CONCENTRAZIONE PLASMATICA. SONO IN COMMERCIO ALTRI METODI BASATI SULLO SVILUPPO DI COLORAZIONE (TESTS CROMOGENICI), IL CUI IMPIEGO TROVA OGGI LARGO IMPIEGO NEI METODI AUTOMATIZZATI.

45. POSSIBILI DIFETTI DELL’EMOSTASI ESPLORATA MEDIANTE I TEST DI COMUNE IMPIEGO

46. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. METODI PER IL DOSAGGIO DEL FIBRINOGENO (FATTORE I) a) Metodi basati sulla precipitazione specifica b) Metodi immunologici dosaggio di tutta la proteina c) Metodi chimici e cinetici funzione della molecola

47. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. aPTT (v-n. 30-40 sec.) LA DETERMINAZIONE DELL’APTT NON PRESENTA PARTICOLARI DIFFICOLTA’, ANCHE SE UNA CERTA DIFFERENZA DI RISULTATI PUO’ ESSERE EVIDENZIATA IN RELAZIONE AL MATERIALE CHE VIENE UTILIZZATO PER DARE INIZIO ALLA COAGULAZIONE. ESISTONO, INFATTI, METODI CHE IMPIEGANO IL CAOLINO ED ALTRI CHE IMPIEGANO L’AC. ELLAGICO; ENTRAMBI AGISCONO SULLA VIA INTRINSECA INNESCANDO LA REAZIONE COAGULATIVA DAL FATTORE XII (DENOMINATO ANCHE FATTORE “CONTATTO”).

48. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. aPTT IL SUO IMPIEGO NELLA DIAGNOSTICA E’ MOLTO DIFFUSO PERCHE’ E’ IN GRADO DI RISPONDERE ALLA DOMANDA SE TUTTI I FATTORI DELLA COAGULAZIONE SONO PRESENTI E FUNZIONALMENTE ATTIVI: IN PRESENZA DI DIFETTI CONGENITI O ACQUISITI DI FATTORI COAGULATIVI SI AVRA’, INFATTI, UN ALLUNGAMENTO DEL SUO VALORE. VIENE USATO, ANCHE, NEL MONITORAGGIO DELLA TERAPIA EPARINICA (UN VALORE 2-3 VOLTE LA NORMA INDICA TERAPIA EPARINICA CORRETTA)

49. LA RACCOLTA CONSAPEVOLE DEL CAMPIONE BIOLOGICO G.L.P. PT (SORVEGLIANZA TAO) QUESTO TEST (Valori normali: 12-14 sec. oppure 80-100%) HA OGGI UNA GRANDE RICHIESTA PER IL MONITORAGGIO DELLA TERAPIA ANTICOAGULANTE (T.A.O.) NEL TRATTAMENTO E NELLA PREVENZIONE DELLE TROMBOEMBOLIE E NEI PAZIENTI PORTATORI DI PROTESI VALVOLARI CARDIACHE.

50. INDICAZIONI ALLA TERAPIA ANTICOAGULANTE