Universität Bielefeld SFB 613

1. Universität Bielefeld SFB 613 K8 Untersuchung der Funktionsdynamik integraler Membranproteine mit oberflächenverstärkter FTIR-Spektroskopie und Einzelmolekülfluores-zenzmikroskopie M. Nack1, K. Ataka1, J. Heberle1, T. Niehörster2, S. Doose2, und M. Sauer2 1 Biophysikalische Chemie, Fakultät für Chemie 2 Angewandte Laserphysik und Laserspektroskopie, Fakultät für Physik Ziele Dieses Projekt soll die funktionelle Dynamik von integralen Membranproteinen mittels zeitauf-gelöster und oberflächenverstärkter FTIR-Spektroskopie sowie Einzelmolekülfluoreszenz kombiniert mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer aufklären. Durch die Entwicklung dieser komplementären Spektroskopieverfahren soll der • Arbeitsplan • Orientierte Immobilisierung der Membranproteine Bacteriorhodopsin und F1F0-ATP-Synthase und Rekonstitution in eine Lipiddoppelschicht • SEIDA-Spektroskopie unter Variation der Transmembranspannung • Etablierung der frequenzmodulierten SEIDAS • Zeitaufgelöste SEIDAS an Membranproteinen • Selektive Fluoreszenzmarkierung der • Membranproteine • FRET-Experimente mit alternierender • Laseranregung mit und ohne Stimulation Abb. 1: Membranproteine und ihre Funktionen molekulare Reaktionsmechanismus von Proteinen wie der F0F1-ATPase und Bakteriorhodopsin, beide verantwortlich für die Sicherstellung des zellulären Energiehaushalts, mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden. Vorhaben • Beantragte Mittel • 2 Doktorandenstellen • Kleingerät (Inkubationsschüttler): 9.500 € Abb. 2: Komplementarität der eingesetzten Methoden SEIRAS und Einzelmolekülmikroskopie/SICM. • Oberflächenverstärkte FTIR- • Spektroskopie (SEIRAS) • In-situ-Beobachtung der spezifischen Bindung von Proteinen an Festkörperoberflächen • Verstärkung der IR-Banden durch Au-Nanopartikel. • dichte Proteinbelegung mit anschließender Rekonstitution in Lipiddoppelschicht. • Stimulation der Proteinfunktion durch Licht, Strom oder Spannung. • Erstmalige Aufnahme reaktions-induzierter Differenzspektren (SEIDAS) einer Proteinmonoschicht [1]. • Entwicklung der AC-modulierten SEIDAS für erhöhte Sensitivität und für zeitaufgelöste Experimente. • Zeitauflösung im µs-Bereich. • Komplementär zur oberflächen-verstärkten Raman-Spektroskopie • Einzelmolekülfluoreszenz- • mikroskopie / SICM • Selektive Markierung von Membranproteinen mit einem Donor (Cy3B, ATTO 590, ATTO 620) und Akzeptorfarbstoff (ATTO 647 N, ATTO 680) mit einem R0-Wert von ca. 5 nm • Immobilisierung auf transparenten leitenden Oberflächen (Gold, ITO) in geeigneter Dichte, eingebettet in eine Membran • Alternierende Laseranregung im Weitfeld und Totalreflektion (TIRF-Mikroskopie) und spektral separierte Detektion des Donor- und Akzeptorsignals auf zwei Bereichen einer EMCCD-Kamera • FRET-Experimente unter gleichzeitiger Anlegung einer Membranspannung mit einer Zeitauflösung im Millisekundenbereich / Rotationsexperimente mit ATP-Synthasen • Konfokale Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt mit der Ionenleitfähigkeits-mikroskopie (Scanning Ion Conductance Microscopy, SICM) zum Studium der Konformations-dynamik mit µs-Zeitauflösung. Adressierung einzelner Membranproteine durch Spannungs-änderung oder Ionengabe über die Mikrokapillare • Vernetzung im SFB • A2 (Schmid): Simulationen von Membranen • A5 (Seidel, Sauer, Dietz): V-ATPase • A6 (Godt, Gölzhäuser): Ni-NTA-SAM auf Goldoberflächen, AFM • K5 (Mattay, Anselmetti): zeitaufgelöste SEIDAS an oberflächengebundenen Calixarenen • D7 (Staiger, Sauer): Imaging und Einzelmolekül-fluoreszenz, zirkadiane Rhythmik • D11 (Niemann, Heberle): Expression und Reinigung von Membranproteinen • Z2 (Heinzmann, Hütten): Charakterisierung der oberflächengebundenen Proteine durch Elektronenmikroskopie. Schlussfolgerung Die oberflächenverstärkte FTIR-Spektroskopie und die Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie stellen zueinander komplementäre Methoden dar, die eine zeitlich sowie spektral hochaufgelöste Analyse der Funktionsdynamik von integralen Membranproteinen ermöglichen. Publikationen [1] X. Jiang, E. Zaitseva, M. Schmidt, F. Siebert, M. Engelhardt, R. Schlesinger, K. Ataka, R. Vogel, J. Heberle, Resolving Voltage-Dependent Structural Changes of a Membrane Photoreceptor by Surface-Enhanced IR Difference Spectroscopy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 25, 1234-1239 (2008). [2] K. Ataka, J. Heberle, Bioenergetics at the Gold Surface, Biochem. Soc. Trans. 36, in press.

2. Lock-In Verstärker 150 s m 0 100 1 / s t n 50 u o C 5 0 10 15 20 Time (s) Mikroskop objektiv I,λ (X,Y,t) CCD-Kamera / Photodiode Fluoreszenzlicht Strahlteiler Laser Anregungslicht Spiegel Universität Bielefeld SFB 613 K8 Zusatzinformation Appendix A Oberflächenverstärkte FTIR-Spektroskopie (SEIRAS) • Gerichtete Bindung von Proteinen an funktionalisierte Goldoberflächen über endständige Thiole (Cys) oder Affinitätsmarker (Ni-NTA oder strep-tag). • In situ Rekonstitution in eine Lipiddoppelschicht zur Funktionalitätssicherung der Proteine. • Lichtinduzierte IR-Differenz-Spektroskopie an einer Monoschicht des archaebakteriellen Membranproteins sensory rhodopsin II [1]. • Spannungsabhängige Unterschiede der licht-induzierten SEIDA-Spektren von SR II (Abb. 3) weisen den Einfluss des Membranpotentials auf die Funktionalität von Membranproteinen auf molekularer Ebene nach. • Mit Hilfe der Anschubfinanzierung durch den SFB 613 konnte die frequenzmodulierte SEIDAS entwickelt werden (Abb. 4). • Erste SEIDA-Messungen unter Einsatz der Modulationstechnik bestätigen die Anwendbarkeit auf Untersuchungen oberflächengebundener Moleküle (Abb. 5) Abb. 3: Lichtinduzierte SEIDA-Spektren einer Einzelschicht von SRII unter verschiedenen Transmembranspannungen Abb 5: Potentialmodulierte SEIDA-Spektren einer Monoschicht eines Thiol-terminierten Methyl-viologens (MV-SAM) auf Gold. Das Potential wurde zwischen -0.5 und -0.1 V (vs. Ag/AgCl) mit einer Frequenz von (a) 33 Hz, (b) 47 Hz, and (c) 73 Hz moduliert. (d) Stationäres redox-induziertes Differenzspektrum der MV-SAM. Abb. 4: Experimenteller Aufbau der frequenz-modulierten SEIDA-Spektroskopie Appendix B Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie / Scanning Ion Conductance Microscopy FRET-Mikroskopie und Konformationsdynamik: Donor/Akzeptor-markierte DNA-Hairpins in PBS immobilisiert auf einer Glasoberfläche via Biotin/ Streptavidin-Bindung. Anregung des Donors (hier Cy3B) resultiert in Abhängigkeit von der Konformation des Hairpins (offen oder geschlossen) in einem effizienten Energietransfer zum Akzeptor (hier Cy5). Abb. 6: Fluoreszenzbild und topographisches Bild (SICM) einzelner farbstoffmarkierter Glutamattransporter auf einer Glasoberfläche. Mikroelektroden verstärker Piezo- Aktuator Bei der Ionenleitfähigkeitsmikroskopie (SICM, Scanning Ion Conductance Microscopy) wird der Ionenstrom durch eine Mikrokapillare mit einem Öffnungsdurchmesser von ca. 50-100 nm im pA-Bereich gemessen. Der gemessene Ionenstrom wird durch den Abstand der Kapillare von der Oberfläche kontrolliert. Die Kapillare wird hierbei in z-Richtung moduliert und die Antwort mittels Lock-in Technik bestimmt. Hierdurch erreichen wir axial eine topographische Auflösung von ca. 5 nm. In lateraler Richtung wird die Auflösung durch den Öffnungsdurchmesser der Mikrokapillare bestimmt. Die funktionelle Dynamik einzelner integrierter Membranproteine soll durch alternierende Laseranregung und FRET-Mikroskopie sowohl mittels Weitfeld- als auch mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie unter Anlegen einer Membranspannung mit µs bis ms-Zeitauflösung studiert werden. Kontrolle + Datenanalyse Abstandsteuerung und Rasterung 1 .. 10 kHz 10 .. 100 nm Z (X,Y,t) XYZ-Piezotisch Abb. 7: Kombination von SICM und TIRF-Mikroskopie. [3] P. Tinnefeld, M. Sauer, Branching-out of single-molecule fluorescence spectroscopy: Challenges for chemistry and influence on biology, Angew. Chem. Int. Ed.44, 2642-2671 (2008). [4] S. Doose, M. Sauer, Fluoreszenz bringt Licht ins Dunkel, Physik Journal 6, 55-60 (2007). [5] H. Neuweiler, M. Sauer, Exploring life by single-molecule fluorescence spectroscopy, Anal. Chem. 77, 179A-185A (2005).